环状糊精是淀粉经酶降解环化而制备的具有筒状疏水内腔的化合物，合成大环糊精的酶是麦芽糖转糖基酶(amylomaltase EC 2.4.1.25)，该酶存在于许多微生物或植物(如土豆中的D-酶)中，参与麦芽低聚糖代谢利用，由于其在生物体内的含量很低，无论是作为研究来源还是用于制备大环糊精，都不能满足需求。本文分别从E.coli K12和Streptomyces ST66中扩增到MalQ基因，采用不同的表达载体，成功构建了两株高效表达的基因工程菌Ecoli BL21/pET-DsbA-MalQ和E.coli TOP10F/pTrc-CKS-MalQ。首次系统地研究了麦芽糖转糖基酶MalQ基因的克隆与表达、表达的融合蛋白的分离纯化、酶学性质以及其催化直链淀粉环化的特性；同时首次采用水解酶--α-淀粉酶于非水相体系中反向催化直链淀粉环化合成大环糊精，并系统研究了其反应条件。主要得出了如下结论： 1.从链霉菌库筛中筛选到了3株高产麦芽糖转糖基酶的菌株，并且证实在麦芽糖诱导下Streptomyces ST66和Ecoli K12中麦芽糖转糖基酶的酶活较高。在分析淀粉被环化时，采取了反应混合物与碘试剂反应后吸光值不断下降但还原糖量却基本不变的方法，来判断淀粉与碘试剂结合力下降的原因是形成了环状糊精。进一步采取淀粉酶水解证实在环化混合物中含有较高的抗葡萄糖淀粉酶水解的淀粉，从而证实了在细胞经超声波破碎后的离心上清液中含有麦芽糖转糖基酶，进一步证实该酶属于胞内酶。 2.用PCR方法扩增E.coli K12 MalQ基因，将该基因插入原核表达载体pET-DsbA中，对质粒所含外源片段双向测序，经在线软件分析，发现其有一个2085bp的完整ORF，编码694个氨基酸，并经BLAST比较分析，确认其与GenBank中报道的E.coli K12 MalQ基因的同源性高达99％。重组质粒转化Ecoli BL21(DE3)plysS，构建一株高效基因工程菌E．coli BL21/pET-DsbA-MalQ，经IPTG诱导后以融合蛋白形式表达，SDS-PAGE电泳显示MalQ基因与DsbA表达的融合蛋白在目标位置约103kDa附近有明显条带。经薄层层析分析粗酶液酶处理的麦芽三糖溶液，证实粗酶液具有麦芽糖转糖基酶活性，提示融合蛋白不仅是可溶性的，而且具有麦芽糖转糖基酶活性。 3.用PCR方法扩增Streptomyces ST66 MalQ基因，将该基因插入原核表达载体pTrc-CKS中，对质粒所含外源片段双向测序，经在线软件分析，发现其有一个2136bp的完整ORF，编码711个氨基酸，并经BLAST比较分析，证实其与GenBank中报道的Streptomyces coelicolor MalQ基因的同源性高达97％。重组质粒转化Ecoli Top 10F’，构建一株基因工程菌Ecoli Top 10F’/pFrc-CKS-MalQ，经IPTG诱导后以融合蛋白形式表达，SDS．PAGE电泳显示MalQ基因与CKS表达的融合蛋白在目标位置约106kDa处有明显条带。经薄层层析分析粗酶液酶处理的麦芽三糖溶液，证实粗酶液具有麦芽糖转糖基活性。提示融合蛋白不仅是水溶性的，而且具有麦芽糖转糖基酶活性。 4.通过6His的分离标签，联合采取硫酸铵盐沉淀，半透膜透析和亲和层析等方法，纯化了目标蛋白。通过分别使用凝血酶切割来自基因工程菌Ecoli BL21/pET-DsbA-MalQ的融合蛋白，人鼻病毒14亚型3C蛋白酶切割来自E.coli ToP10F/pTrc-CKS-MalQ的融合蛋白，证明两个来源基因翻译的蛋白质都具有麦芽糖转糖基酶活性。 5.对纯化后两种酶的酶学性质研究表明，两个不同微生物来源基因表达的麦芽糖转糖基酶的最适温度有一定的差异。来自大肠杆菌的MalQ基因翻译的酶的最适温度为37℃，而来自链霉菌的MalQ基因翻译的酶的最适温度为30℃。来自大肠杆菌的MalQ基因翻译的酶在pH介于5.5～8.0时酶活基本稳定，而来自链霉菌的MalQ基因翻译的酶在pH介于5.5～7.5酶活基本稳定。在温度稳定性方面，两个来源的酶均不耐温，当处理温度小于45℃时，酶的活力基本保持在最高活性的80％以上，相对稳定。当处理温度高于50℃时，酶活力急剧下降。在酶的pH耐受方面，两个来源酶的pH稳定范围均较宽，在pH5.5～8.0范围内较稳定，且在pH 6.5～7.5酶活基本不变。金属离子和EDTA对酶活性的影响实验表明。EDTA对酶活的影响不大，但Zn2+，Cu2+，Hg2+，Ag+对酶蛋白有较强的抑制作用，抑制作用最明显的是Hg2+，Ag+，而Ca2+，Mg2+，Mn2+等对酶有一定的激活作用。 6.通过研究影响外源基因在E.coli中表达效率的因素，发现不同的基因工程菌达到最大产酶的诱导时间不同，基因工程菌E.coli BL21/pET-DsbA-MalQ诱导时间为2.5 h，即达到了最佳诱导时间，而基因工程菌E.coli TOP10F/pTrc-CKS-MalQ则需要3h才达到最佳诱导时间。诱导温度也影响诱导表达效率，在低温诱导时，产酶能力一直处于较高的水平，而以30℃诱导较佳，当温度较高于40℃时，产酶能力急速下降。诱导剂IPTG的浓度明显影响表达。当诱导剂的浓度介于0.4～1.0mmol/L之间，诱导效果最好，而IPTG浓度低于0.4mmol/L时，阻遏能力不够，不利于表达。当IPTG浓度高于1.0mmol/L时，因为其毒性，导致细胞活力下降而影响表达。开始诱导的时间对诱导效率也非常重要，最佳的诱导时间是OD600介于0.4～0.8之间。在优化的诱导发酵条件下，基因工程菌E.coli BL21/pET-DsbA-MalQ产麦芽糖转糖基酶的酶活为13.5U，与该基因来源的野生菌E.coliK12相比，基因工程菌为野生菌产酶能力的15倍；而基因工程菌E.coliTOP10F/pTrc-CKS-MalQ产麦芽糖转糖基酶的酶活为10.3U，为野生菌该基因来源的Streptomyces ST66产酶能力的10.6倍。 7.使用薄层层析法鉴定了粗酶液催化的产物，证实了诱导表达的粗酶液能够催化直链淀粉环化成大环糊精。温度对大环糊精的形成效率影响明显，合成大环糊精的最适温度为30～35℃。反应混合液的pH值不同，其合成大环糊精的效率也不同，合成大环糊精的最适pH值介于5～6.5之间，较低的pH值有利于大环糊精的合成。研究了大环糊精的合成随时间的变化，发现当反应进行到5h时，基本达到反应平衡，此时形成的大环糊精约占初始底物的65％。超过5h，即使增加反应时间到20h，产物也没有继续增加。底物浓度也极大的影响大环糊精的合成效率。当底物浓度较低时，有利于大环糊精的合成，当浓度低到0.05％，合成的大环糊精占初始底物的80％，大环糊精在反应体系里的浓度约为0.04％。 8.应用α-淀粉酶非水相反向催化合成了大环糊精。通过不同二甲基亚砜浓度的实验，发现α-淀粉酶在水份含量较多的时候表现出较高的水解酶活性，而反应体系中水份含量下降到20％时，α-淀粉酶对淀粉的水解能力急剧下降，与此同时，其催化直链淀粉反向缩合的能力不断上升。α-淀粉酶合成大环糊精的产率都随着反应体系中底物浓度的增大而下降。而当使用α-淀粉酶催化直链淀粉逆向缩合环化时，其最适温度介于35～55℃，需20h才达到平衡。