【摘 要】
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目的:糖尿病肾病（diabetic nephropathy,DN）是糖尿病患者最严重的并发症之一,其发病机制复杂,越来越多的研究表明脂毒性在DN的发表机制中起着重要作用。棕榈酸（palmitate acid,PA）是体内游离脂肪酸组成中最丰富的饱和脂肪酸之一,肾小球系膜细胞为肾脏的固有细胞,对脂毒性敏感,也是糖尿病肾病的主要靶点。成纤维细胞因子21（FGF21）是FGF超家族的独特成员,在代谢中发
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目的:糖尿病肾病（diabetic nephropathy,DN）是糖尿病患者最严重的并发症之一,其发病机制复杂,越来越多的研究表明脂毒性在DN的发表机制中起着重要作用。棕榈酸（palmitate acid,PA）是体内游离脂肪酸组成中最丰富的饱和脂肪酸之一,肾小球系膜细胞为肾脏的固有细胞,对脂毒性敏感,也是糖尿病肾病的主要靶点。成纤维细胞因子21（FGF21）是FGF超家族的独特成员,在代谢中发挥多效作用,有研究表明FGF21是肾脏的保护因子。因此本研究探讨棕榈酸在诱导人肾小球系膜细胞（human mesangial cell,HMC）凋亡中的作用以及重组人成纤维细胞因子21（recombinant human fibroblast growth factor 21,rhFGF21）在PA诱导HMC凋亡中的保护作用,并进一步研究rhFGF21对内质网应激反应的调节在PA诱导HMC凋亡中的具体作用及机制,为rhFGF21在糖尿病肾病的防治中提供相关理论依据。方法:体外培养HMC细胞,分组如下:（1）PA诱导HMC细胞凋亡和SIRT1增加的剂量效应:不同浓度的PA:0μmol/L（正常对照组）,200μmol/L,400μmol/L,600μmol/L,800μmol/L,1000μmol/L分别作用于HMC细胞24h;（2）PA诱导HMC细胞凋亡和SIRT1增加的时间效应:选定浓度的PA分别作用于HMC细胞12h,18h,24h;（3）rhFGF21对HMC细胞的保护作用及对SIRT1表达的影响:正常对照组,PA模型组,rhFGF21治疗组;（4）SIRT1敲低对HMC细胞凋亡的影响:正常对照组（Ctrl-RNAi）、PA模型组（Ctrl-RNAi+PA）、rhFGF21治疗组（Ctrl-RNAi+PA+rhFGF21）、SIRT1敲低组（p GPU6-SIRT1+PA+rhFGF21）。CCK8法检测细胞活性;Annexin-Ⅴ/FITC/PI双染流式细胞仪检测细胞凋亡情况;免疫荧光法检测HMC细胞内FGF21蛋白的表达情况;Real-time PCR检测HMC细胞内FGF21、GRP78、ATF4、CHOP的m RNA变化情况;Western blot测定HMC细胞内FGF21、p-FGFR1、β-Klotho、GRP78、ATF4、CHOP、Bax、Bcl-2、Cleved-caspase3、SIRT1蛋白表达情况。结果:（1）随着PA作用浓度的增加,HMC细胞活力逐渐降低,600μmol/L的PA能够诱导HMC细胞的凋亡,内质网应激相关蛋白GRP78、ATF4、CHOP含量逐渐增加,m RNA水平与蛋白水平一致;（2）随着PA作用时间的增加,HMC细胞中凋亡相关蛋白BAX、Cleved-caspase3含量逐渐增加,抗凋亡蛋白Bcl-2逐渐减少,FGF21及其受体p-FGFR1,辅助受体β-Klotho蛋白含量逐渐增加;（3）rhFGF21浓度在1-10nmol/L时对HMC细胞活力没有明显影响,结果显示5nmol/L的rhFGF21可以明显减少PA诱导的HMC的凋亡,增加细胞活力,降低HMC细胞中凋亡相关蛋白BAX、Cleved-caspase3的含量,增加抗凋亡蛋白Bcl-2的含量,减少内质网应激相关蛋白GRP78、ATF4、CHOP的含量,m RNA水平与蛋白水平一致;（4）PA能够上调HMC细胞中SIRT1蛋白的表达,且表现为一定的剂量效应和时间效应,rhFGF21在PA的基础上进一步上调HMC细胞中SIRT1蛋白的含量;（5）SIRT1的敲低,增加了HMC细胞中凋亡相关蛋白BAX、Cleved-caspase3的含量,降低了抗凋亡蛋白Bcl-2的含量,逆转了rhFGF21的治疗作用;（6）SIRT1的敲低,增加了内质网应激相关蛋白GRP78、ATF4、CHOP的含量,逆转了rhFGF21的治疗作用。结论:棕榈酸诱导的人肾小球系膜细胞的凋亡可能与细胞内质网应激反应有关,rhFGF21能够缓解棕榈酸刺激的人肾小球系膜细胞的凋亡,其具体机制可能与上调HMC细胞中SIRT1的表达,降低内质网应激的水平,进而降低凋亡相关蛋白Bax、Cleved-caspase3的表达,而增加抗凋亡蛋白Bcl-2的含量有关,从而起到细胞保护作用。
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