恒温扩增结合阳离子共轭聚合物可视化检测miRNA

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Micro RNA(miRNA)对生命活动具有重要的调节作用,其在生物体内的表达与疾病的发生、发展相关联。因此,发展简便、灵敏的miRNA检测方法对于疾病的早期诊断和治疗具有重要意义。本论文利用催化发夹组装(CHA)和超支化滚环扩增(HRCA)技术,通过设计不同荧光猝灭探针,结合阳离子共轭聚合物(CCP)均相生物传感技术,发展了两种可视化检测miR-221的新方法。具体内容如下:一、CHA技术结合CCP均相荧光可视化检测miR-221。首先针对目标miR-221序列设计发夹探针P1和P2。其中P1探针5¢端部分序列与目标miR-221序列互补。P2探针的两端分别标记了猝灭基团(BHQ1)和荧光基团(FAM),二者距离相近,FAM荧光被BHQ1猝灭。当反应溶液中有目标miRNA时,其打开P1的双链结构,并使P1与P2探针通过杂交反应形成P1P2双链产物,同时顶替miRNA序列。顶替下的miRNA又会引发P1和P2的杂交反应,通过CHA扩增,生成大量的P1P2双链DNA产物。产物P2中BHQ1和FAM基团远离,导致荧光释放。当溶液中加入CCP,其与双链P1P2通过静电力结合,并发生从CCP到FAM的高效荧光共振能量转移(FRET)。利用紫外灯照射,溶液呈现绿色荧光。相反,虽然CCP也可与P2结合,但由于P2自身猝灭状态,导致CCP与FAM之间不能发生有效的FRET。方法线性范围为5-100 pM,检出限(3s)为4.5 pM。利用CHA扩增和CCP荧光传感,该方法实现了miR-221的特异定量检测;可为即时检测技术研究提供新思路。二、超支化滚环扩增(HRCA)结合CCP荧光可视化检测miR-221。首先,设计与目标miR-221序列完全互补的挂锁探针(PLP)和HRCA反应中的正向和反向引物。其中反向引物为双链荧光猝灭开关探针,其5¢端(BHQ1标记)部分序列与3¢’端标记FAM的一条短链DNA互补。当目标miR-221存在时,PLP在特异连接酶作用下连接成环,再通过加入正、反向引物引发HRCA。反应中,反向引物中的FAM标记的DNA链会被持续顶替、释放到溶液中。HRCA反应后加入CCP,其与释放的FAM标记DNA结合并发生高效FRET,在紫外灯照射下显示绿色荧光。根据荧光转移效率及可视化荧光信号与miR-221的浓度关系,可实现miR-221的简便、灵敏检测。此方法检测线性范围为25 f M-1 pM,检出限18 f M。该方法中通过设计双链荧光猝灭开关探针作为反向引物引发HRCA,结合CCP荧光传感,可降低荧光背景,更易于可视化检测。
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