燕麦光周期不敏感基因克隆与分析

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燕麦是禾本科(Gramineae)燕麦属(Avena)的重要粮食兼饲草作物,世界各国种植的燕麦以普通栽培燕麦(Avena sativa L.)为主,为六倍体(2n=6x=42)品种,同时燕麦也是一种营养价值很高的作物。燕麦在世界各地广泛栽培种植,中国燕麦的栽培历史已有2100年之久,主要分布在华北、西北和西南。燕麦生长需要一定的自然条件,其中光周期是最重要影响因素之一,其不仅影响燕麦的生育期,同时影响产量,因此优良品种的选育和引进就显得非常重要。燕麦属于长日照作物,一般品种在苗期必须经过长日照阶段才能正常开花结实,这一特性使其在地理分布和播种时间受到限制。种植实践中发现有一部分燕麦在短日照下可以正常开花结实,因此这一部分燕麦属于光周期不敏感品种。由光周期不敏感品种培育出的极早熟燕麦,有效的利用了无霜期前后燕麦生长时期,使燕麦由原来的一年一熟变为一年双熟,单位面积产量升高,极大的提高了燕麦的种植效益。本研究将不同来源的11个燕麦品种同时种在网室观察燕麦的生长情况,结果表明各品种开花时间不尽相同,选择白燕10号(早开花),VOA-8(中开花),AC-Navan和白燕1号(晚开花)种在光照培养箱中分长短日照进行光周期模拟实验,结果表明燕麦品种VOA-8在长短日照条件都开花,因此VOA-8的基因组中可能带光不敏感基因。将VOA-8与白燕1号2个燕麦品种种植在长短日照条件下,利用cDNA-AFLP技术对燕麦光周期相关基因表达差异进行研究分析,两个品种间发现了大约1987条TDF(Transcript-derived fragments),其中323条TDF是差异表达的,占16%左右,两个品种的基因型差别比较大。对回收的108条TDF序列进行分析,有28条TDF与已知功能基因有较高的同源性,这些基因分别参与了光合作用和能量(7,6.48%)、信号转导(5,4.63%)、代谢(4,3.70%)、转录(3,2.78%)、翻译(3,2.78%)、次生代谢(2,1.85%)、转座子元件(2,1.85%)、防御响应(1,0.93%)和转运(1,0.93%)。其中TDF140是短日照下从燕麦品种VOA-8分离出来的,与小麦光周期Ppd-D1基因同源性较高,突变体Ppd-D1a是光周期不敏感基因,认为VOA-8基因组携带的Ppd基因可能与光周期不敏感性状有关。为了进一步验证这一结果,采用Real-time qRT-PCR技术对9个相关的TDF进行研究分析,结果表明品种VOA-8在短日照下的TDF140表达量比白燕1号增高了3-7倍,且与小麦光周期基因同源性较高,初步证明品种VOA-8带有光周期相关基因(Oats Photoperiod–OPpd)。根据OPpd表达量结合VOA-8品种的表现型(长短日照都正常开花)可以认为OPpd能诱导VOA-8品种在短日照条件下正常开花,这表明OPpd可能是一个燕麦光周期不敏感基因(Oats Photoperiodinsensitive-OPpdi),我们将该光照不敏感新基因命名为OPpdi。为了获得燕麦光照不敏感基因OPpdi,我们采取了RACE方法对未知基因OPpdi进行扩增,通过3’RACE和5’RACE已获得了特异性较高的条带,拼接3’端和5’端序列最终获得了2669bp全长的基因序列,通过比对与已知TDF140序列一致。ORF分析得到1983bp完整的开放阅读框,推测编码660个氨基酸,这一结果证明该片段已有完整的基因编码区,可以进一步进行基因功能分析。BLAST分析表明OPpdi基因的氨基酸序列与小麦、大麦等植物的PRR氨基酸同源性很高,PRR是植物的光周期调控蛋白,在小麦和大麦中这个蛋白是由光周期基因Ppd编码,Ppd的突变体是光周期不敏感基因,可使小麦大麦在长短日照条件下都早开花。保守区分析及多重序列比对表明OPpdi基因蛋白与PRR蛋白有很高的一致性。系统进化树分析表明这个基因的蛋白与小麦大麦的PRR蛋白关系很近,因此认为本研究克隆的燕麦光周期不敏感OPpdi基因与小麦和大麦的光周期基因(Ppd)具有同样的功能和作用。燕麦VOA-8光周期不敏感基因OPpdi的克隆,对燕麦光周期变化的理解和认识提供了重要信息,对今后利用光周期不敏感基因培育一年双熟燕麦品种具有重要的理论价值和应用价值。
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