细菌获得性免疫系统中II型CRISPR(clustered,regularly interspaced,short palindromic repeat;CRISPR)系统的CRISPR/Cas9核酸酶做为第三代基因编辑技术近年来被广泛应用。CRISPR/Cas9技术主要依靠单向导RNA(single-guide RNA,sg RNA)与基因组序列的碱基互补配对实现精准基因编辑,但是该识别模块对于碱基的错配具有一定的容忍度,从而导致脱靶效应(off-target effects)。脱靶效应的存在严重制约着该技术的应用,尤其在转基因动物生产方面会引起基因组的插入和缺失(insert and deletes,indels)、癌症的发生和转基因动物生产效率低下等问题。因此,对CRISPR/Cas9技术脱靶效应的检测和评估也成为研究热点。本研究首先使用在线预测工具Zi Fi T和Cas-OFFinder在牛ROSA 26基因座中初步筛选出全基因组范围内潜在脱靶位点最少的sg RNAs序列,然后利用CIRCLE-seq的方法对不同的sg RNAs在对应位点的脱靶活性进行检测,以期全方位评估CRISPR/Cas9技术在转基因牛培育过程中的脱靶效应。主要研究内容如下:1.牛ROSA 26基因座内潜在打靶位点体外切割效率检测。利用Cas-OFFinder在牛ROSA 26基因座上筛选出11、34和45号位点,并设计对应的sg RNAs。将Cas9-sg RNAs复合物与体外扩增的靶位点序列共孵育,通过凝胶电泳成像与灰度分析检测不同靶位点的切割效率。结果表明各打靶位点上的切割效率具有明显差异,其中11号位点切割效率最高,其次是34号位点,45号位点无明显的切割作用。2.牛基因组片段化与环化及CRISPR/Cas9体外切割反应。为了保证基因组片段化效果,本研究采用微球菌核酸酶、接触式超声仪和非接触式超声仪对基因组进行片段化处理,并对比了这三种途径的打断效率和重复性。结果表明在超声循环数固定为9次的条件下,非接触式超声仪的打断效率和重复性最高,可以将最佳浓度的牛基因组样品(120 ng/μL)处理为300～500 bp DNA片段。随后通过连接反应为片段化DNA添加具有回文序列的接头,经由系列酶促反应使其环化。最后将环化基因组片段与sg RNAs共孵育,并利用PCR扩增与Sanger测序鉴定靶位点环化及切割效果,最终得到了可用于后续自建库的样品。3.CIRCLE-seq自建库及测序结果基因打靶验证。通过设置Adapter和Input DNA的摩尔比梯度,探究最佳的自建库反应体系。结果表明对于100 ng～500 ng的Input DNA,Adapter:Input DNA摩尔比为100:1时可达到最好的建库效果。通过使用Qubit荧光定量和q PCR定量相结合的方式可以及时监测测序接头连接反应和文库扩增反应的进行。基于CIRCLE-seq结果,通过基因打靶阳性克隆筛选与统计,验证了11号位点实际打靶效率最高,证明该方法可用于建立转基因牛生产中脱靶效应的评估标准。综上所述,本研究通过对CIRCLE-seq技术反应体系进行了优化,该方法首次被应用于牛的ROSA 26基因座上的脱靶效应检测,这对提高抗病转基因牛新品种培育过程中的基因打靶效率具有重大意义。