病理性心肌肥厚是高血压、心肌缺血、糖尿病心肌病等多种疾病的常见合并症,它是多种神经体液因素介导、多种细胞信号通路参与的复杂病理生理过程。组织学上的肥厚性重构（remodeling）在早期可代偿性增加心输出量,但不断发展可导致心脏收缩功能失代偿最终发生心力衰竭。与肥厚性重构相伴的是心肌电生理重构,使得心律失常的发生率大大提高,由此导致的心源性猝死（Sudden cardiac death,SCD）约占心衰病人死亡的50%。而现有抗心律失常药物大多同时具有潜在的致心律失常风险而使用受限。因此,揭示电重构致心律失常发生的分子机制、寻找新的防治靶点是近年心血管领域研究的重要课题。各种实验动物模型及心衰病人心室细胞电生理记录发现,心肌电生理重构最突出的表现是心肌细胞复极化过程变慢而致动作电位时程（APD）延长,在体表心电图表现为QT间期的延长（属于获得性LQT综合症）。复极延迟易发生早后除极（EAD）引发触发电活动,加上复极离散度的增大导致兴奋折返而发生室性快速性心律失常。已知心肌细胞膜上存在各种电压门控性K+通道,包括瞬时外向K+通道(电流为Ito)、快、慢延迟整流K+通道(对应电流成分为IKr、IKs),是决定APD和动作电位形态的关键分子基础。其中Ito是包括人在内的大动物心脏快速复极1期的主要电流,而在啮齿类小动物则是整个复极期的主要电流成分;IKr（通道孔区亚单位由h ERG基因编码）和IKs（通道由亚单位基因KCNQ1和β亚单位基因KCNE1编码）是大动物2相平台、3相复极的主要电流。过去的10-20年间,大量的实验研究发现,心肌肥厚导致APD延长的最为可能的原因是不同K+电流密度的减小。已在不同原因（包括心室快速起搏、后负荷过高）所致的多种心肌肥厚、心衰动物（包括小鼠、大鼠、兔、犬等）模型及心衰的人心室肌细胞观察到Ito密度减小;除Ito外,肥厚、心衰时IKr、IKs亦减小。鉴于K+电流减小是心肌肥厚心律失常的主要原因,人们尝试用通道开放剂增大K+电流来对抗病理性APD延长。实验显示选择性IKs通道开放剂可以对抗肥厚兔心室细胞APD延长,取消EAD的出现;多种IKr通道开放剂亦表现出同样的对抗病理性电重构的防治效果,我们的前期实验亦观察到,IKr开放剂在离体心脏可以有效预防APD延长所致的室速和室颤（VT/VF）。因此,使用K+通道开放剂可望成为治疗心肌肥厚心律失常的新策略。然而,近年临床发现K+通道gain of function突变造成短QT（SQT）综合症具有引发室颤的危险,似乎又提示这些K+通道开放剂缩短QT间期可能具有潜在的致心律失常风险。我们最近观察到不同的IKr和IKs开放剂在离体灌流心脏引发VT/VF,动作电位钳下记录外向K+电流发现这些开放剂增大外向复极电流的同时改变电流形状,特别是早期复极电流增大,在APD和ECG参数中表现为相应的早期复极时间缩短,缩短程度与心律失常发生高度相关,这表明改变通道动力学增大K+复极电流与阻断通道减小K+电流的药物一样存在致心律失常风险。那么,如何另辟新径来增大K+电流呢?已知通道电流的大小取决于通道动力学和细胞膜上功能通道的数量,后者除受基因转录、蛋白合成调控外,近年的研究发现,细胞膜通道蛋白的转运是影响IKr和IKs通道细胞膜表达量的关键因素,细胞膜通道蛋白数量取决于两个反方向转运过程:一是正向转运,通道蛋白在内质网（ER）合成经转运囊泡到高尔基体转运至细胞膜上（上膜）;二是膜上的通道蛋白内化（internalization）进入早期内体（early endosome）,部分可以再循环到细胞膜上,另外一部分进入晚期内体（late endosome）,经蛋白酶体或溶酶体途径降解。而泛素化是通道膜蛋白内化的第一步,实验表明,E3泛素连接酶成员Nedd4-2是启动此反应的关键分子,它与目标蛋白的PY序列呈特异结合使其泛素（Ub）化。电压门控性K+通道中h ERG和KCNQ1的C末端具有PY序列,Nedd4-2可以将其泛素化而进入早期内体,细胞内调节运输小泡的小G蛋白RAB5促进Nedd4-2的泛素化过程,而RAB11促进早期内体再循环至细胞膜上。由上可见,正向转运障碍和/或降解过程加速均可造成膜通道数量减少。我们的前期实验显示,在异源表达细胞上心肌病理肥厚关键体液因素血管紧张素II（Ang II）显著下调成熟h ERG蛋白,分析发现此作用与其加速膜成熟蛋白的降解有关;另有研究显示,血管紧张素II可显著加速动脉血管细胞膜上BKCa(大电导Ca2+激活的K+通道)的内化与降解。因此我们假设通道泛素化降解增多致膜通道蛋白数量减少是心肌肥厚病理状态下IK电流减小的重要原因,抑制泛素化过程将增多膜通道数量而增大IK电流,有效预防心肌肥厚电重构导致的心律失常。第一部分病理性心肌肥厚电重构模型的建立目的:在豚鼠整体水平建立心肌肥厚电重构模型。方法:通过颈背部皮下置入渗透泵的方式持续给予Ang II（0.6 mg/kg/d）两周造成豚鼠心肌肥厚。采用小动物超声心动和分离组织称重的方法观察豚鼠心脏的整体收缩功能和组织结构;HE染色和Masson染色的方法观察心肌细胞大小和纤维化程度;RT-PCR技术检测心肌肥厚相关因子m RNA含量;体表ECG记录豚鼠在体ECG;分离豚鼠心肌细胞,采用电流钳技术记录APD;Langendorff灌流条件下,给予豚鼠心脏PES电刺激诱发心律失常,观测心律失常易感性。结果:超声心动结果显示:与对照组（CON）相比,模型组（Ang II）左室收缩末期前壁、后壁、室间隔厚度均明显增大,CON组（n=7）分别为:1.67±0.024,1.63±0.025,0.93±0.066 mm;而Ang II（n=7）:2.07±0.055,2.01±0.06,1.18±0.028 mm,P<0.05 vs CON);舒张末期左室前壁、后壁、室间隔厚度也明显增大（CON:1.34±0.057,1.21±0.051,0.75±0.072 mm;Ang II:1.7±0.064,1.6±0.058,0.98±0.027 mm,P<0.05 vs CON）。组织重量结果显示,与对照组相比,模型组心脏重量和左室重量均显著增加（CON:3.35±0.021,2.01±0.038mg/g;Ang II:4.11±0.13,2.67±0.12mg/g,P<0.01vs CON）。HE染色结果显示,模型组心肌细胞面积较对照组明显增大（CON:150.72±46.62μm2,Ang II:368.8±84.19μm2,P<0.001 vs CON）;Masson染色表明,模型组心肌纤维化面积较对照组明显增多（1.28±0.46%,21.78±6.4%,P<0.05 vs CON）。RT-PCR检测肥厚相关因结果显示,与对照相比,模型组肥厚相关因子（ANP、β-MHC、TGF-β）m RNA表达均显著升高（P<0.05 vs CON）。通过记录豚鼠在体ECG发现,模型组豚鼠QTc间期明显延长（10.88±0.16,12.2±0.37,P<0.05 vs CON）。分离豚鼠心肌细胞记录APD发现,模型组心肌细胞APD50与APD90均显著延长（CON:419.28±25.04,460.66±25.04ms;Ang II:731.9±49.53,821.08±42.25ms,P<0.001 vs CON）。离体灌流条件下给予电刺激观察豚鼠心脏发生心律失常的阈值,结果显示,模型组发生心律失常的阈值明显降低（172.5±11.91,110±14.14m A,P<0.01 vs CON）,在给予相同强度电流刺激（130m A）下,对照组均未发生心律失常,模型组5/6发生心律失常。小结:通过颈背部皮下置入渗透泵的方式持续给予Ang II两周可以造成豚鼠左室明显肥厚和电重构化改变,表现为左室壁和室间隔增厚,心肌细胞面积增大和纤维化程度加大,心电图QT间期延长,心肌细胞APD延长,诱发心律失常的阈值明显降低。第二部分心肌肥厚电重构中延迟整流钾通道的改变及机制目的:研究心肌肥厚电重构模型中延迟整流钾通道的变化及机制。方法:分离豚鼠心肌细胞,采用全细胞膜片钳技术记录延迟整流钾电流(IKr,IKs);RT-PCR技术检测豚鼠心肌组织ERG基因和KCNQ1基因的表达水平;Western Blot方法检测豚鼠心肌组织ERG蛋白、KCNQ1/KCNE1蛋白、Nedd4-2/p-Nedd4-2及Rab11蛋白的表达水平;采用Co-IP的方法分析ERG、KCNQ1与Nedd4-2蛋白之间的相互作用以及ERG蛋白泛素化水平。结果:膜片钳结果显示,与对照组心肌细胞相比,模型组IKs无明显变化,IKr尾电流密度明显减小（电压为+60m V时,CON:0.51±0.0754 p A/p F,Ang II:0.28±0.0456 p A/p F,P<0.05 vs CON）。RT-PCR检测结果发现,与对照相比,模型组ERG基因表达无明显变化,KCNQ1基因则明显增高。Western Blot结果表明,KCNQ1和KCNE1蛋白表达两组均无明显差异,而ERG蛋白在模型组心肌组织出现明显下调（包括成熟和非成熟ERG蛋白）;Nedd4-2和Rab11蛋白在模型组的表达明显上调,而磷酸化的Nedd4-2（p-Nedd4-2）表达则明显减少。Co-IP结果提示,与对照组相比,模型组心肌组织中ERG蛋白与Nedd4-2之间的相互作用增强,而KCNQ1与Nedd4-2之间的作用则无明显差异;同时,ERG与Ub小分子之间相互作用增强,表明ERG蛋白泛素化水平在模型组心肌中显著增强。小结:1.在豚鼠心肌肥厚电重构模型中,IKr明显减少,而IKs无显著改变。2.编码IKr的ERG蛋白表达明显降低,而ERG基因的表达没有明显变化,提示通道蛋白减少是由转录后调节所致;进一步发现E3泛素连接酶Nedd4-2表达明显上调,ERG蛋白的泛素化水平也明显增加,表明通道蛋白泛素化降解增多是导致通道数目减少、钾电流减小的重要原因。第三部分激活血清糖皮质激素激酶（SGK1）对豚鼠心肌肥厚电重构的影响目的:鉴于SGK1对K+通道内化转运的调节作用,观察在整体动物水平观察激活SGK1对于心肌肥厚电重构的影响。方法:采用腹腔注射SGK1激活剂C4-CER和静脉注射含有心肌特异启动子c Tn T和活性SGK1（S422D）基因的腺相关病毒AAV-9表达载体两种方式在豚鼠心脏激活SGK1,观察其对豚鼠心肌肥厚及电重构的影响。采用小动物超声心动和分离组织称重的方法观察豚鼠心脏的整体功能和组织结构;HE和Masson染色的方法观察心肌细胞大小和纤维化程度;体表ECG记录豚鼠在体ECG;Western Blot方法检测豚鼠心肌组织ERG蛋白、KCNQ1蛋白、Nedd4-2/p-Nedd4-2及SGK1/p-SGK1蛋白的表达水平。结果:超声心动结果显示,模型组豚鼠左室明显增厚,而C4-CER并未改善这种增厚,反而有加重的趋势;组织称重结果显示,模型组豚鼠出现明显的心脏和肺重量增加,左心室和室间隔重量明显增大,而同时给予C4-CER组豚鼠各组织重量并未改善,肺和心脏重量反而较模型组更增大。体表心电图检测结果显示,模型组出现明显QT间期延长,而C4-CER反而有加重这种延长的趋势。注射携带活性SGK1（S422D）的腺相关病毒能部分预防模型组左室壁的肥厚,但不能对抗心肌细胞面积的增大和纤维化的增强以及心电图QT间期的延长。Westernblot结果显示,两种激活SGK1的方式均可以明显增加磷酸化SGK1和ERG蛋白量而对KCNQ1蛋白表达量无影响。进一步观察发现,C4-CER和SGK1（S422D）均未能对抗模型组p-Nedd4-2蛋白的下调,而对于心肌肥厚病理条件下过表达的Nedd4-2蛋白,活性SGK1病毒可以预防这种过表达,而C4-CER则无此作用。小结:SGK1的直接激活可以抑制Nedd4-2从而增加ERG蛋白表达,但并不能有效改善豚鼠心肌肥厚和QT间期延长的病理状态。提示激活SGK1信号通路对电生理具复杂的调节作用。第四部分在豚鼠心肌中过表达突变型Nedd4-2对心肌肥厚电重构的影响目的:在豚鼠心肌中过表达突变型Nedd4-2（m）,观察其对心肌肥厚电重构的影响方法:构建含有心肌特异启动子c Tn T的突变型Nedd4-2（C801S）基因及e GFP荧光蛋白基因的腺相关病毒AAV-9表达载体,采用静脉注射的方法给豚鼠注射,于注射后4周检测豚鼠组织荧光含量。确定表达后再进行心肌肥厚模型的建立。分离心肌细胞和固定组织采用冰冻切片技术制备心肌细胞悬液和组织切片,在荧光显微镜下观察心肌细胞和各组织荧光强度;采用小动物超声心动的检测方法观察豚鼠室壁厚度;体表ECG记录豚鼠在体ECG,比较QTc间期的变化;分离豚鼠心肌细胞,采用电流钳技术记录APD;分离豚鼠心肌细胞,采用全细胞膜片钳技术记录延迟整流钾电流(IKr和IKs);采用Co-IP的方法分析ERG蛋白泛素化水平。结果:荧光显微镜观察结果显示,注射AAV-9病毒4周以后,e GFP主要在心脏中表达,其他组织并未见明显荧光。并且在心脏组织中,左心室表达比心房和右心室更多;造模结束后,模型组5只豚鼠死亡2只,而过表达Nedd4-2（m）的豚鼠未见死亡;超声结果显示,与对照组（CON）相比,模型组（Ang II）豚鼠出现明显左室壁和室间隔增厚,而实验组（Ang II+Nedd4-2（m））的豚鼠左室壁和室间隔出现明显改善;单纯注射病毒与CON相比无明显变化。体表ECG结果显示,与对照组（CON）相比,模型组（Ang II）豚鼠出现明显QTc间期延长,而过表达Nedd4-2（m）的豚鼠出现明显改善,恢复至对照水平;单纯注射病毒的对照对QT间期无明显影响。分离心肌细胞记录APD结果发现,与对照组（CON）相比,模型组（Ang II）豚鼠APD50和APD90明显延长,过表达Nedd4-2（m）使APD50和APD90均恢复至对照水平;注射病毒对照动物与CON相比无明显变化。膜片钳结果显示,模型组豚鼠出现明显的IKr电流减小,而过表达Nedd4-2（m）显著增大IKr电流,并且明显高于CON组水平。注射病毒的对照豚鼠与CON相比无明显变化。而IKs电流密度在四组动物间均无明显差异。免疫共沉淀检测结果表明,与模型组组相比,过表达Nedd4-2（m）的豚鼠心肌细胞ERG蛋白泛素化水平明显减弱。小结:在心脏特异过表达Nedd4-2突变体（C801S）可以有效预防病理性心肌肥厚ERG蛋白泛素化降解,增大IKr电流。第五部分合成短肽对Nedd4-2所致h ERG蛋白降解的抑制作用目的:观察基于h ERG蛋白特异的PY序列合成的短肽对Nedd4-2所致ERG蛋白降解的抑制作用。方法:在稳定表达h ERG蛋白的HEK293细胞系上转染不同量的Nedd4-2质粒,采用Western Blot和全细胞膜片钳方法检测h ERG蛋白表达量和h ERG电流;转染一定量的Nedd4-2质粒的同时,给予不同浓度带有细胞穿透肽的PY序列短肽（根据Nedd4-2与h ERG蛋白结合位点序列设计）,用激光共聚焦的方法观察短肽是否导入细胞,采用Western Blot和全细胞膜片钳方法检测h ERG蛋白表达量和IKr电流,观察PY短肽对Nedd4-2的抑制作用。结果:Western Blot结果显示,给予三个不同量的Nedd4-2质粒（500ng、1000ng、2000ng）均显著降低膜上成熟的h ERG蛋白（155k Da而非135k Da）的表达。膜片钳结果也显示,不同量的Nedd4-2质粒均明显减小h ERG电流（电压为+50m V时,CON:55.83±6.56 p A/p F,500ng:24.85±2.14 p A/p F,1000ng:25.55±2.02 p A/p F,2000ng:29.55±2.22 p A/p F,P<0.001 vs CON）。其中,1000ng Nedd4-2与2000ng对h ERG蛋白和h ERG电流的抑制没有明显差异,所以后续采用1000ng Nedd4-2质粒转染。共聚焦显微镜下观察发现,同时给予三个浓度的PY短肽（100 n M、200 n M、500 n M）均可以成功导入细胞内。Western Blot结果显示,与对照组相比,Nedd4-2明显减少h ERG蛋白量,同时给予三个浓度的PY短肽均可以明显恢复h ERG蛋白表达量至对照组水平,而随机乱码肽则无明显作用。膜片钳结果也显示了相同的结果,三个浓度PY短肽均显著恢复h ERG电流至对照水平,乱码肽则无明显作用（电压为+50m V时,CON:55.83±4.55 p A/p F,Nedd4-2:21.92±1.67p A/p F,Scrambled peptide（500 n M）:22.71±2.06 p A/p F,PY peptide（100n M）:45.31±3.63 p A/p F,PY peptide（200 n M）:45.75±2.55 p A/p F,PY peptide（500 n M）:50.95±3.06 p A/p F）。小结:根据Nedd4-2与h ERG蛋白结合位点序列设计的PY短肽可以有效抑制Nedd4-2对于h ERG蛋白和h ERG电流的下调作用。结论:本实验结果表明,病理性心肌肥厚条件下h ERG（ERG）泛素化降解增加是导致IKr电流减小的主要机制,干预泛素化中介的通道蛋白降解可望为改善病理性电重构、防治心律失常提供新的治疗靶点。