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背景:1989年Thim首先发现并命名了一个新的蛋白质家族,鉴于其氨基酸序列中存在一段特殊的核心序列,其间的6个半胱氨酸按1-5,2-4和3-6的顺序,依次以二硫键两两相接,形成3个环状结构,形如三片叶子,故将其称之为“三叶因子家族”（Trefoil factor family,TFF）,简称三叶肽（Trefoil peptide）。该家族包括:乳腺癌相关肽（breast cancer-associated peptide,pS2或TFF1）、胰解痉肽（pancreatic spasmolyticpolypeptide,SP或TFF2）和肠三叶因子（intestinal trefoil factor,ITF或TFF3）。三叶肽主要在胃肠道表达,其他组织中没有或仅有少量表达。生理状态下TFF1在胃粘膜表达;TFF2在胃和胰腺表达;TFF3在肠道表达。大量研究表明,三叶肽对胃肠粘膜具有重要的保护作用,被誉为消化道的“超级保护因子”,受到国内外学者和制药企业的广泛关注。1982年Masiakowski首先发现并命名了三叶肽家族的第一个成员pS2至今已愈25年。人们对三叶肽进行了多方面的深入研究,包括在体内的分布、基因定位、重组表达、基因敲除、理化性质、抗体制备、氨基酸序列分析、空间结构确立以及大量的功能学研究。但三叶肽临床应用研究进展缓慢,迄今国内外尚未见三叶肽应用于临床治疗的报道,关键原因在于三叶肽的获取非常困难。三叶肽在组织中含量有限,组织提取法成本高,产量低;多肽合成无法保证正确的空间结构,合成产物无生物活性。采用基因工程的方法是最佳选择,但无论是原核还是真核表达系统,都各自存在一些缺陷和不足,使重组表达和纯化过程烦琐,产量不高,导致生产成本过高,限制了其工业化生产和临床应用。鉴于此,有必要探索一种高效、快捷、低成本的重组表达方式,为三叶肽大规模工业生产和临床应用奠定理论基础。目的:分别构建rhTFF1和rhTFF2融合蛋白大肠杆菌表达载体,在大肠杆菌中重组表达,以获取高纯度的重组融合蛋白;对重组表达的hTFF1和hTFF2融合蛋白的理化性质和生物活性进行相关研究。方法:1.rhTFF1和rhTFF2融合蛋白在大肠杆菌中的表达和纯化:通过RT-PCR分别获得hTFF1和hTFF2成熟肽cDNA序列,克隆至质粒pET32a获得重组载体;双酶切后转化至Origami B（DE3）进行诱导表达,优化表达条件获得最大表达产量;Ni-NTA亲和层析、超滤离心纯化重组蛋白。2.rhTFF1和rhTFF2的鉴定:通过重组质粒测序、SDS-PAGE和Western blot鉴定重组蛋白。3.rhTFF1和rhTFF2融合蛋白理化性质的研究:将纯化后的rhTFF1和rhTFF2融合蛋白分别置于模拟胃肠道环境的液体中:①不同浓度的胰蛋白酶,37℃消化4h;②不同浓度的胃蛋白酶,37℃消化4h;③pH值2.0-12.0的缓冲液中,37℃孵育5h。采用Non-reducing Tricine SDS-PAGE分析残余rhTFF1和rhTFF2融合蛋白的百分比,观察在模拟胃肠道环境中rhTFF1和rhTFF2融合蛋白的稳定性。4.rhTFF1和rhTFF2融合蛋白体外生物学活性研究:①采用MTT法和CCK-8法观察rhTFF1和rhTFF2融合蛋白对MKN-28细胞增殖活性的影响;②采用MKN-28细胞机械损伤模型,观察rhTFF1和rhTFF2对细胞移行速率的影响。5.rhTFF1和rhTFF2融合蛋白体内生物学活性研究:采用灌胃无水乙醇和30%体表面积（total body surface area,TBSA）Ⅲ°烧伤小鼠模型,观察rhTFF1和rhTFF2融合蛋白对两种致伤模型小鼠胃粘膜损伤和修复的影响。结果:1.获得hTFF1和hTFF2成熟肽cDNA序列,与Genbank数据库所收录的基因序列完全一致,成功构建含目的基因的重组载体pET32a-hTFF1和pET32a-hTFF2;在大肠杆菌Origami B（DE3）中进行表达,表达产物主要集中在细菌胞质中,有少量包涵体形成（小于30%）。重组hTFF1和hTFF2融合蛋白产量分别约169.6mg/L和246.5mg/L。2.Western blot证明重组蛋白具有良好的抗原性和特异性;通过Ni-NTA亲和层析、超滤离心后得到95%以上纯度的重组蛋白。3.rhTFF1融合蛋白在胰酶/蛋白质量比为1:100时即发生水解,降解为rhTFF1二聚体的形式,随着胰蛋白酶的浓度逐渐升高,rhTFF1二聚体的比例也逐渐下降,至胰酶/蛋白比为1:1时,rhTFF1二聚体已全部降解;而rhTFF2融合蛋白直至胰酶/蛋白质量比为1:1时,融合蛋白仍有65.3%残留。rhTFF1和rhTFF2融合蛋白在胃蛋白酶/蛋白质量比为1:1时,经过4h消化,rhTFF1和rhTFF2融合蛋白残余量分别为73.7%和50.7%。在pH值2.0-12.0的缓冲液中,37℃水浴5h后,rhTFF1和rhTFF2融合蛋白残余量为90%-98%。4.rhTFF1和rhTFF2融合蛋白能促进MKN-28细胞增殖和移行,其最低有效浓度分别为10μg/ml和30μg/ml。5.无水乙醇灌胃小鼠和烧伤小鼠分别给予1mg/kg的rhTFF1或rhTFF2融合蛋白灌胃,能显著降低胃粘膜受损程度。灌胃无水乙醇6小时损伤最重,此时对照组小鼠胃粘膜广泛出血,呈现大面积的片状或条索状出血病灶,rhTFF1和rhTFF2融合蛋白治疗组损伤明显减轻,糜烂面和出血点明显较少,3组胃粘膜损伤指数分别为（36.66±10.14,13.33±2.42,24.83±3.53,P＜0.05～0.01）,胃粘膜病理改变也明显减轻。烧伤小鼠胃粘膜损害在伤后24小时最重,对照组胃粘膜出现肉眼可见的大量出血点,以点状或粟米粒状为主,rhTFF1和rhTFF2融合蛋白治疗组损伤明显减轻,出血点明显较少,3组胃粘膜损伤指数分别为（6.16±1.95,2.00±1.15,3.5±0.95,P＜0.05～0.01）。损伤对照组胃粘膜病理改变以糜烂、出血、坏死和溃疡为主,治疗组病理改变明显减轻,以充血、水肿为主。结论:1.rhTFF1和rhTFF2融合蛋白在大肠杆菌系统的表达取得成功,表达的融合蛋白可溶性好。较经典的重组表达具有以下优势:①省略了原核表达因形成包涵体过多需要复杂的复性过程;②无需采用昂贵的肠激酶酶切目的蛋白;③无需盐析浓缩目的蛋白;④在保持生物活性的同时降低了表达成本20%左右。2.rhTFF1融合蛋白具有较好的胃蛋白酶抗性和酸碱稳定性,但胰蛋白酶抗性较差。3.rhTFF2融合蛋白具有较好的胃、胰蛋白酶抗性和酸碱稳定性。4.体外实验证明,rhTFF1和rhTFF2融合蛋白可促进体外培养细胞的增殖速率,加快细胞向受损区域移行。5.体内实验显示,rhTFF1和rhTFF2融合蛋白对乙醇灌胃和烧伤后胃粘膜损害具有明显的治疗作用。比较而言,rhTFF1融合蛋白的保护效应优于rhTFF2融合蛋白。