研究背景:肺血管重构是一个复杂而又多因素的过程,肺动脉内皮细胞功能紊乱是肺血管重构启动和发展的重要因素。肺动脉内皮细胞功能紊乱可致血管源活性介质,炎症因子等调节因子表达异常,肺动脉内皮细胞以及平滑肌细胞异常增殖及间质转化。因此,肺动脉内皮细胞增殖及凋亡的异常是导致肺血管重构的重要因素。有研究表明,自噬是调节肺动脉高压和内皮细胞增殖、功能紊乱的决定因素。磷酸化的Atg101能够启动自噬装配器,是自噬起始复合物的重要组成部分,同时还可启动和招募下游的自噬相关蛋白,维持自噬前体复合物的稳定性,是参与调控自噬的必需基因。低氧情况下,肺动脉内皮细胞中Atg101高表达,抑制Atg101的表达可调控肺动脉内皮细胞的异常增殖,维持内皮细胞稳态,调控肺血管重构的发生和发展。自组装DNA纳米材料具有可编程性、无毒性、无免疫原性,可同时携带多种功能分子等特点,在生物医学中的应用受到越来越多的关注和重视。自组装DNA纳米材料可作为药物载体,递送siRNA、CpG、蛋白质以及阿霉素等。同时,由于DNA纳米材料自身具有高负电性,且合成需要较高浓度的盐溶液体系,不利于生物及医学应用研究。同时,镁离子介导组装的DNA纳米材料仍然存在易被酶降解、单核巨噬细胞系统清除、细胞摄取效率低下等诸多问题,亟需发展新的DNA组装策略来适应其在纳米生物学、纳米医学等方面的应用。目前有两种DNA纳米组装策略:一是利用金属阳离子如镁离子等介导DNA纳米结构自组装;二是利用变性剂如尿素或甲酰胺等非传统方式组装DNA纳米结构。氮掺杂碳量子点是一类单层或多层石墨烯结构的碳纳米颗粒,具有较好的生物兼容性、优异的发光效应以及独特的表面活性。氮掺杂碳量子点（NCD）表面含有氮元素,其在中性溶液中带正电荷。同时,氨基分子如亚精胺（Spd）是生命活动所需的,他们都是线性的,质子化的高价离子化合物。氮掺杂碳量子点以及氨基分子都带正电荷,可以与负电荷的DNA或RNA相互作用,存在介导DNA组装成规整纳米结构的潜力。基于以上背景,我们提出一种非传统组装DNA纳米材料的策略,即利用带正电功能性大分子物质或纳米颗粒介导无镁离子存在的DNA纳米结构自组装,构建一种功能性的客体分子-DNA复合纳米材料。在本研究中,拟利用亚精胺和氮掺杂碳量子点介导组装DNA纳米系统,与Atg101 siRNA结合,构建一种新型的亚精胺或氮掺杂碳量子点/DNA复合纳米药物递送系统,并在肿瘤细胞中评估新型复合纳米材料的生物安全性及应用潜力,进而将其应用于调控肺血管重构的纳米医学及其他潜在生物医学应用。研究方法:1.自组装DNA纳米材料的设计根据碱基互补配对原则,我们依据模块组装策略利用SEQUIN软件设计了DNA纳米三棱柱以及DNA纳米三角板纳米结构。通过对部分DNA单链序列特殊设计,使其能够与功能基团如si RNA、核酸适配体等互补配对结合,从而构建功能化的DNA纳米材料。2.非传统自组装DNA纳米材料的合成及表征亚精胺以及氮掺杂碳量子点组装的DNA纳米材料通过聚丙烯酰胺凝胶电泳法（PAGE）以及激光动态散射法（DLS）进行表征。同时,观察NCDs或亚精胺在不同p H值、浓度、温度下对DNA纳米材料组装行为的影响,优选出合适的合成条件。3.非传统自组装DNA纳米材料在肿瘤细胞中毒性作用及摄取效率研究（1）通过MTT法检测亚精胺和氮掺杂碳量子点对肿瘤细胞的毒性。（2）通过PAGE检测氮掺杂碳量子点介导组装的DNA纳米材料的血清稳定性,并且将其介导组装的DNA纳米材料作为药物递送载体携带KRAS si RNA,通过PAGE表征评估其合成产率。（3）通过激光共聚焦以及流式法检测肿瘤细胞对亚精胺和氮掺杂碳量子点介导组装的DNA纳米材料的摄取效率。（4）利用蛋白质印迹法检测氮掺杂碳量子点介导组装的DNA纳米材料作为药物递送载体携带KRAS si RNA对肿瘤细胞相关蛋白表达量的影响。4.非传统自组装DNA纳米材料调控肺血管内皮屏障功能及机制研究（1）通过激光共聚焦法检测肺动脉内皮细胞对携带Atg101 siRNA和核酸适配体（Aptamer）的功能化DNA纳米三角板（DNA Nano Triangle,DNT-APT）摄取情况以及观察DNT-APT纳米材料对肺动脉内皮细胞的靶向能力。（2）通过激光共聚焦法检测DNT-APT纳米材料在低氧条件下对肺动脉内皮细胞屏障功能的影响。（3）通过蛋白质印记法检测DNT-APT纳米材料对相关蛋白表达水平的影响,以及自噬相关蛋白LC3B II/I和PCNA等表达情况。（4）应用野百合碱化学方法构建小鼠肺动脉高压模型。研究结果:1.DNA纳米结构的设计与构建:我们通过SEQUIN软件设计了模块组装（Tile-based）DNA纳米结构,如DNA纳米三棱柱以及功能化的DNA纳米三角板。通过PAGE表征,其合成产率较高,且通过DLS测量,其粒径大小均符合结构理论值。2.亚精胺和氮掺杂碳量子点介导DNA纳米材料自组装:（1）NCD能够成功介导DNA纳米三棱柱的组装。实验表明NCD能够在浓度为30μg/mL时介导DNA纳米三棱柱的合成,当NCD pH值在7.0～9.0时,可以高产率的介导DNA纳米三棱柱的组装。同时,研究结果显示氮掺杂碳量子介导组装的DNA纳米三棱柱在4 ^oC,22 ^oC,37 ^oC下放置2 h后,通过PAGE法表征,其产率较高,达到75%左右。DLS对氮掺杂碳量子介导的DNA纳米三棱柱(NanoPrism,NP^NCD)进行测量,其尺寸在11.1±1.6nm,与理论值相符。（2）亚精胺能够介导DNA纳米管以及DNA纳米三棱柱的组装。同时,通过在37 ^oC,22 ^oC下放置2 h后,仍能介导DNA纳米管的组装;当亚精胺p H值在6.5-7.5时,能够介导DNA纳米管的组装。3.亚精胺或氮掺杂碳量子点组装的DNA纳米材料在肿瘤细胞中的验证研究:（1）通过MTT法检测亚精胺和氮掺杂碳量子点对肿瘤细胞的毒性作用。实验结果表明,NCD在浓度为10-500μg/m L时,对肿瘤细胞无毒性作用;而亚精胺在浓度为20μM时开始显现出其对肿瘤细胞的毒性作用,可能为亚精胺本身对肿瘤细胞有杀伤作用。（2）NP^NCD在血清中稳定性相对较高:相较于镁离子介导的DNA纳米三棱柱(NP^Mg),NP^NCD能够在第6 h时保持DNA纳米三棱柱的完整性。（3）通过激光共聚焦以及流式法发现NP^NCD更容易被细胞所摄取,在A549细胞以及NCL-H23细胞中其摄取效率是NP^Mg的6倍或2.6倍。同样的,亚精胺介导组装的DNA纳米管和DNA纳米三棱柱均能被细胞高效摄取,还证明了亚精胺介导组装的DNA纳米材料是通过网格蛋白内吞途径进入细胞,最终定位在溶酶体内。（4）通过对DNA纳米三棱柱二链功能化设计,使NCDs介导的DNA纳米三棱柱能够携带KRAS si RNA(NP^NCDK),并作用于相应的肿瘤细胞。通过MTT以及WB实验结果表明,相比于镁离子介导的功能化DNA纳米三棱柱(NP^MgK),NP^NCDK能更有效的抑制肿瘤细胞的增殖以及KRAS蛋白的表达水平。4.功能化DNA纳米三角板对肺动脉内皮细胞屏障功能以及肺动脉高压小鼠肺动脉内皮细胞的影响:（1）通过PAGE胶对DNT-APT进行表征,其合成产率较高;且经DLS测定,其粒径为16.88±2.33 nm,符合理论设计值。（2）激光共聚焦检测肺动脉内皮细胞对DNT-APT的摄取效率以及靶向能力。实验结果表明,肺动脉内皮细胞对DNT-APT的摄取有一定的时间依赖性,在48 h时,其摄取效率最高;通过对HPAECs和HUVECs反筛,Aptamer能够特异结合HPAECs,DNT-APT能够靶向性的被HPAECs识别摄取。（3）激光共聚焦法以及WB实验结果发现,HPAECs在低氧条件下屏障功能出现明显破坏,连结蛋白表达量显著降低;当DNT-APT作用后,屏障功能明显改善,相应的连结蛋白表达水平明显升高。（4）利用野百合碱构建小鼠肺动脉高压模型。免疫组化实验结果表明,相较于生理盐水组,野百合碱组小鼠的肺血管管壁明显变厚,管腔明显变窄,肺动脉高压小鼠模型构建较为成功。结论:1.成功设计并构建了两种自组装的DNA纳米结构:DNA三棱柱和DNA纳米三角板。并对两种结构进行了进一步设计:每个DNA纳米三棱柱可携带6个KRAS siRNA;每个DNA三角板在携带3个Atg101 siRNA同时,可携带3个针对HPAECs的核酸适配体。PAGE、DLS、AFM等结果表明,上述结构构建成功。亚精胺和氮掺杂碳量子点能够在梯度退火和恒温条件下成功介导Tile-based DNA纳米结构自组装。其组装行为与亚精胺及氮掺杂碳量子点浓度、p H值密切相关。2.亚精胺和氮掺杂碳量子点构建的新型功能化复合DNA纳米系统具有优异的性能和应用潜力:（1）相对于传统镁离子介导组装的DNA纳米材料,亚精胺介导组装的DNA纳米管以及NP^NCD可被细胞高效摄取,且NP^NCD具有较好的血清稳定性;（2）NP^NCD携带KRAS siRNA(NP^NCDK)可高效抑制肿瘤细胞中KRAS蛋白表达水平。相较于镁离子介导组装的功能化DNA纳米三棱柱,NP^NCDK能更好的抑制肿瘤细胞的增殖。（3）复合纳米材料系统兼容性好,细胞毒性低。3.优选出功能化DNA纳米三角板,使其同时携带Atg101 si RNA和核酸适配体,可被肺动脉内皮细胞高效摄取且表现出较好的靶向能力。平面化的纳米结构以及三个Aptamer活性靶点的设计,能够保证纳米材料和细胞的高选择性、高效结合;同时,功能化DNA纳米三角板的介入,可有效抑制低氧条件下肺动脉内皮细胞异常增殖,并一定程度保护屏障功能。下一步,同时结合氮掺杂碳量子点、Aptamer、siRNA的复合纳米材料构建及调控肺血管重构研究正在进行中。