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随着工业化的发展,人类对能源和工业化学品的需求也日益增长。合成气(Syngas),是一种主要由CO、CO2和H2等组成的廉价气体,一般由石油、液化天然气气化产生,也可来自工业生产排放的的工业废气或者由生物质和城市废物气化产生,它们通常被直接排放到大气中或通过燃烧处理。近来,利用厌氧自养产乙酸菌(Acetogen)发酵合成气或富含CO的废气来生产生物燃料和化学品的技术引起了人们的关注。这类产乙酸厌氧菌可以以CO2或者CO为唯一碳源进行生长,经过Wood-Ljungdahl途径(WLP)固定CO2和CO合成乙酰-CoA,进而生成乙酸、乙醇和2,3-丁二醇等化合物,本文所用菌株Clostridium ljungdahlii即为厌氧产乙酸菌的一种。比起化学法转化合成气,微生物发酵转化有诸多优点,如细菌对气源中的污染物有较强的耐受能力;细菌对CO/H2含量比值没有特定要求,可通过基因操作设计细菌的代谢途径,使发酵产物多样化。尽管发酵受到气液物质转移的限制且需厌氧条件,但上述优势给细菌发酵合成气带来了广阔的应用前景,成为一项极具竞争力的技术。利用产乙酸菌发酵合成气,不但可以减少污染,还可以使废物资源化。本论文主要对厌氧产醇梭菌C.ljungdahlii合成气发酵代谢途径中的关键酶亚甲基四氢叶酸还原酶(MTHFR)和乙醛:铁氧还蛋白氧化还原酶(AOR)等酶的生理生化特征进行了研究,在此基础上讨论了C.ljungdahlii在合成气中生长的能量代谢,具体内容如下:MTHFR是C.ljungdahilii合成气发酵代谢途径迄今未被阐明的关键酶。为了确定MTHFR的编码基因,在严格厌氧条件下利用野生菌蛋白纯化技术获得MTHFR。首先在粗酶中测得甲基四氢叶酸还原人工电子受体苄基紫精(BV)的活性,并利用此活性,依次经过硫铵沉淀,Phenyl-Sepharose,Q-Sepharose,DEAE-Sepharose四步,最终成功获得MTHFR蛋白,并通过蛋白质谱证明C.ljungdahlii的MTHFR是由MetF和MetV两个亚基组成的。通过此方法,将酶纯化了 44倍,平均比酶活为30.7U/mg。为了对其生理条件下的电子供体进行研究,本论文从常用电子供体NAD(P)H、二氢硫辛酰胺还原酶(DLDH)、硫氧还蛋白还原系统和铁氧还蛋白(Fd)四个方面进行研究,确认Fdred2-为MTHFR生理条件下的电子供体,其反应比酶活达到7.4 U/mg。最终得出结论,C.ljungdahlii的MTHFR由两个亚基组成,且催化了一种新类型的生理反应,其生理电子供体是Fdred2-。对其进行了紫外可见光扫描,以及辅因子的鉴定实验,发现棕黄色的MTHFR结合两分子的[4Fe4S]簇,且由异源二聚体组成,这与生物信息学的分析相符。对MTHFR进行了异源表达,获得大量MTHFR蛋白,这为蛋白结晶解析蛋白结构提供了可能。此外,本论文通过亚基数目和系统进化分析,成功将产乙酸菌的MTHFR分为了三类,为厌氧微生物的MTHFR分类提供了新的见解。在研究过程中,本论文成功构建了一种高效表达2[4Fe4S]的厌氧Fd的重组菌株,其Fd产量远高于同类型Fd在其他野生菌和异源表达菌株中的产量,为厌氧产乙酸菌的酸醇代谢研究提供了必需材料。AOR是C.ljungdahlii中酸醇转化的关键酶,在生理条件下,它利用Fdred2-还原乙酸生成乙醛,再通过双功能的醛脱氢酶/醇脱氢酶生成乙醇,完成酸醇转化。在C.ljungdahlii中,AOR有两个同工酶AOR1和AOR2,有研究者分别对其进行了敲除,证明两个酶可能行使不同的功能,然而该推测尚缺乏蛋白分子水平上的证据。因此本研究在严格厌氧条件下对C.ljungdahlii的野生型AOR2蛋白进行了的纯化,依次经过硫铵沉淀,Phenyl-Sepharose,Q-Sepharose,DEAE-Sepharose四步,最终获得红棕色的目的蛋白。通过此方法,将酶纯化了 77倍,平均比酶活为46U/mg(乙醛还原Fd),证明了 AOR2由67kDa的单一亚基组成,并通过凝胶过滤测其分子量,证明AOR2是个同源二聚体蛋白。对其进行了紫外可见光扫描,以及铁含量的测定,证明每个亚基结合有一个[4Fe4S]簇,这与生物信息学的分析相符。本论文证实了C.ljungdahlii中AOR2的生理电子受体为Fd,生理电子供体是乙醛。本论文同样对AOR1进行了部分表征,对假定的AOR1进行了部分纯化,并对其活性进行了测定,对其进一步纯化表征进行了必要的摸索。对AOR2和假定的AOR1进行酶活对比,从蛋白水平上证明两个同工酶可能行使不同的功能。本研究为产醇梭菌生产发酵应用提供了必要的理论基础,也为其菌株代谢工程改造提供理论依据。本论文对以CO为唯一碳源培养的C.ljungdahlii粗酶中关键氧化还原酶进行了活性测定,系统分析了C.ljungdahlii各氧化还原酶的编码基因构成和转录状况,并对绝大多数氧化还原酶生理条件下的电子供体进行了预测。依据粗酶酶活测定及以上研究成果,讨论了合成气(H2和CO2,CO)中生长的C.ljungdahlii的能量代谢,对产醇梭菌复杂的能量代谢机制提出了新的见解。综上结果,通过厌氧培养技术和合成气发酵技术,成功获得以CO为唯一碳源和能源生长的C.ljungdahlii细胞。利用发酵获得的细胞进行蛋白纯化,成功纯化获得了 MTHFR蛋白,证明其只有两个亚基组成,且催化了一种新类型的生理反应,其生理条件下的电子供体为Fdred2-。本研究还纯化获得了酸醇转化的关键酶AOR,证明其生理条件下的电子受体为Fdox,从蛋白水平证明两个同工酶可能具有不同的生理功能。本论文通过对关键酶的研究,完善了产醇梭菌的还原力流向,深入讨论了梭菌合成气发酵代谢机理,讨论了新的合成气发酵能量代谢理解,为合成气发酵产醇的工业化提供了理论基础。