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背景及目的:多发性骨髓瘤(multiple myeloma,MM)是一种恶性浆细胞增殖性疾病,是常见的血液系统恶性肿瘤之一。虽然近年来对其治疗取得了一定进展,如蛋白酶体抑制剂硼替佐米(bortezomib)的应用极大提高了治疗的总反应率,延长了患者生存期,但MM仍不可治愈,复发率高。除初治不敏感的患者外,有近一半的初治敏感患者复发后对硼替佐米治疗的反应性降低,因此寻找新的治疗药物、探索新的联合用药方案是进一步提高MM疗效和预后的关键。Bruton’t酪氨酸激酶(Bruton’t tyrosine kinase,BTK)是一种胞浆酪氨酸蛋白激酶,主要表达于各分化阶段的B细胞,是B细胞抗原识别受体(B-cell antigen receptor,BCR)信号通路的重要组分,对正常B细胞的分化、发育和功能有重要影响。近年的研究表明,BTK在多种B细胞性恶性肿瘤(如慢性淋巴细胞白血病、弥漫大B细胞淋巴瘤、套细胞淋巴瘤)中的表达及活性增高,增强了肿瘤细胞的存活和增殖。ibrutinib是针对BTK的选择性抑制剂,可与BTK活性位点的半胱氨酸残基(Cys-481)共价结合,并抑制其磷酸化激活,从而不可逆地抑制其激酶活性,对BTK的半数抑制浓度(median inhibitory concentration,IC50)为0.5 nmol/L,目前已在慢性淋巴细胞白血病、套细胞淋巴瘤、弥漫大B细胞淋巴瘤中显示了有效的体内外抗肿瘤活性。AVL-292(CC-292)是另一种新型的选择性BTK抑制剂,其作用机制与ibrutinib相似,但对BTK的IC50<0.5 nmol/L。浆细胞是终末分化阶段的B细胞,正常浆细胞中BTK表达量极低甚至无表达,但最近多个研究小组先后在MM患者肿瘤细胞和某些MM细胞系中检测出了BTK的表达。目前有关BTK抑制剂ibrutinib和AVL-292在MM中的研究报道尚少。本研究旨在通过观察、比较两种BTK抑制剂ibrutinib和AVL-292对MM细胞增殖、凋亡的影响以及与临床常用蛋白酶体抑制剂硼替佐米的联合效应,并探讨其可能的效应机制,来明确BTK抑制剂在骨髓瘤治疗中的应用价值,以期为MM治疗提供新的靶点和联合用药方案。方法:1、采用蛋白质印迹(Western blot)法检测人多发性骨髓瘤细胞系NCIH929、RPMI8226细胞中BTK蛋白表达情况。不同浓度ibrutinib、AVL-292单药以及两药分别联合硼替佐米处理NCI-H929、RPMI8226细胞,采用CCK-8法检测细胞增殖,Annexin V-FITC/PI双染流式细胞术检测细胞凋亡,Western blot法检测药物处理前后细胞内BTK、NF-κB(p65)、AKT、ERK蛋白及其磷酸化水平,以及凋亡相关蛋白Bcl-xL、cleaved(活化型)caspase-3的表达水平。2、密度梯度离心法分离MM患者骨髓单个核细胞,体外贴壁法培养骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymalstemcells,bmscs),应用流式细胞术鉴定第3代bmscs免疫表型;用成骨、成软骨、成脂诱导分化培养基培养bmscs,然后分别用茜素红、阿利新蓝、油红o染色法检测培养获得的患者bmscs的成骨、成软骨、成脂特性。3、用ibrutinib、avl-292分别处理患者bmscs,cck-8法检测ibrutinib和avl-292对bmscs增殖的影响,荧光定量rt-pcr法检测ibrutinib和avl-292对bmscs中白介素-6(il-6)基因mrna表达水平的影响。建立mm细胞与bmscs共培养体系,cck-8法检测mm患者bmscs对mm细胞系增殖的影响以及ibrutinib、avl-292对共培养体系中nci-h929细胞增殖的影响。结果:1、nci-h929、rpmi8226细胞中存在btk蛋白表达。2、ibrutinib和avl-292均可抑制nci-h929、rpmi8226细胞增殖,其抑制作用呈浓度依赖性。在nci-h929细胞,当ibrutinib浓度为10、50、100μmol/l,avl-292浓度为5、10、50、100μmol/l时,24h细胞活性与48h细胞活性差异有统计学意义(p<0.05,p<0.01),呈现出时间依赖性。ibrutinib对nci-h929、rpmi8226细胞48h的ic50分别为(10.41±3.29)μmol/l、(51.65±13.58)μmol/l;avl-292对nci-h929、rpmi8226细胞48h的ic50分别为(7.77±2.99)μmol/l、(6.44±1.06)μmol/l。3、不同浓度的ibrutinib(5、10μmol/l)和avl-292(5、10μmol/l)与不同浓度的硼替佐米(5、10、20、50nmol/l)联合应用对nci-h929、rpmi8226细胞的增殖抑制率均高于相应浓度单药组(p<0.05,p<0.01),不同组合的协同系数r均大于1。4、10μmol/librutinib、10μmol/lavl-292和20nmol/l硼替佐米单独作用48h后,nci-h929细胞的凋亡率分别为(16.47±2.70)%、(20.23±3.95)%和(12.40±1.06)%,均较对照组升高(p<0.05,p<0.01);rpmi8226细胞的凋亡率分别为(11.27±1.64)%、(17.50±3.70)%和(6.30±0.92)%,除硼替佐米外均较对照组升高(p<0.05,p<0.01);10μmol/librutinib和10μmol/lavl-292分别与20nmol/l硼替佐米联合后,nci-h929细胞凋亡率分别为(32.20±2.74)%和(38.70±5.03)%,rpmi8226细胞凋亡率分别为(26.60±1.51)%和(35.93±3.11)%,均显著高于相应单药组(p<0.01)。5、10μmol/librutinib单药和10μmol/lavl-292单药作用24h后,nci-h929细胞内btk、nf-κb(p65)、akt和erk的磷酸化水平和抗凋亡蛋白bcl-xl表达水平降低,cleaved(活化型)caspase-3表达水平增加;与硼替佐米联合应用,两药对上述蛋白的调节作用均增强。6、成功获得mm患者骨髓间充质干细胞(mm-bmscs),流式免疫表型分析显示mm-bmscs表达cd73、cd90和cd105,不表达造血细胞标记cd34和cd45;并且经诱导后,bmscs可以向成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞方向分化,具有间充质干细胞(mscs)的特性。7、10μmol/librutinib和10μmol/lavl-292处理48h后,初发/进展期和稳定期患者来源的bmscs的增殖活性较对照组无明显变化(P>0.05),但初发/进展期BMSCs中IL-6 mRNA水平较对照组降低(P<0.01)。8、NCI-H929、RPMI8226细胞与初发/进展期BMSCs共培养48 h后,细胞增殖活性较各自单独培养时升高(P<0.01);与稳定期BMSCs共培养后,细胞增殖活性与各自单独培养时无明显差异(P>0.05)。9、ibrutinib和AVL-292均能抑制与初发/进展期BMSCs共培养的NCI-H929细胞的增殖,10μmol/L ibrutinib和10μmol/L AVL-292能完全阻断BMSCs对NCI-H929细胞的促增殖作用。结论:1、BTK抑制剂ibrutinib和AVL-292对存在BTK表达的多发性骨髓瘤细胞系NCI-H929、RPMI8226有增殖抑制和凋亡诱导作用,并与蛋白酶体抑制剂硼替佐米有协同作用,其机制可能与抑制细胞内BTK激酶活性及下游NF-κB、AKT、ERK信号通路活性、下调抗凋亡蛋白Bcl-xL表达、激活caspase-3依赖的凋亡途径有关。2、Ibrutinib和AVL-292能够抑制与初发/进展期患者BMSCs共培养的NCIH929细胞的增殖,阻断BMSCs对骨髓瘤细胞增殖的刺激作用;还能抑制初发/进展期患者BMSCs中IL-6基因mRNA的表达,但对BMSCs的增殖活性无明显影响。