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从昆虫、鱼类到鸟类以及哺乳动物,性二态性都普遍存在,性别差异表达的因子(包括基因和非编码的RNAs)可以持续调控不同性别的发育,导致胚胎时期和成人时期的两性差异。哺乳动物中性别决定机制已经明确,主要由Y染色体上的决定基因SRY和性染色体上的其他基因调控,然而在鸡中性别决定的具体机制仍不清楚。一些研究表明性别差异表达的miRNAs可能参与性腺发育的过程,但miRNAs在性腺发育中的具体作用机制方面仍需要一个更全面的研究进行深入的探讨。本研究主要分为三个部分:首先,通过高通量测序筛选出了在E5.5雌雄差异表达的miRNAs,并对差异倍数较大的miRNAs进行验证,进而通过生物信息学方法来分析靶基因可能参与的通路和生物过程,筛选出可能参与调节早期性分化过程的miRNAs和靶基因;再者,通过双荧光素酶报告基因法检测miR-107的靶基因预测的准确性,并通过细胞水平的超表达和抑制来确定miR-107与靶基因NR5a1、AMH的直接或者间接的调控关系;最后,在本课题组之前的研究基础上,检测miR-92与靶基因ATRX、DDX3X之间存在的调控关系。1.miRNAs的高通量测序筛选1).我们对性腺发育早期(E5.5)雌性和雄性的性腺进行Solexa深度测序,分析后得到860个已知miRNAs,鸡中有报道的雄性高表达miRNAs有42个,雌性高表达有27个。对log2(fold-change)>2的36个miRNAs进行定量检测,包括20个雄性高表达的miRNAs和16个雌性高表达的miRNAs,其中有12个雄性高表达和6个雌性高表达的miRNAs定量检测的结果与测序结果相符。2).miRNAs的预测靶基因进行了 GO和KEGG分析。GO分析的结果显示这些miRNAs可能参与机体的各个发育过程。一些miRNAs具有广泛的调控作用,另外一些miRNAs只特异性的参与机体的某些过程,如miR-7,miR-2188,miR-1787,miR-2954 和 miR-3533。3).通路覆盖了机体内多个生物学过程,其中与性腺发育相关的通路有卵母细胞的减数分裂(oocytemeiosis),GnRH信号通路和Wnt信号通路。大部分性别差异表达的miRNAs上调卵母细胞的减数分裂,而下调Wnt通路和GnRH通路。2.miR-107可直接调控NR5al的表达1).miR-107的靶基因预测和生物学分析,其中MR5al和AMH在哺乳动物和鸟类中的功能已知,因此我们筛选miR-107和这两个靶基因进行双荧光素酶报告系统的检测。2).NR5al和AMH的双荧光素酶报告系统的检测,结果显示miR-107可以显著抑制NR5al-3’-UTR双荧光素酶的表达活性,AMH-3’-UTR的两个位点都对双荧光素酶的活性没有影响。因此,NR5al是miR-107的靶基因,而非AMH。3).miR-107抑制NR5al的表达,并影响下游CYP19al的水平,而抑制miR-107并不会引起NR5al和CYP19a1的表达升高。4).miR-107的超表达和抑制,都不会引起AMH表达的变化,并与NR5al和CYP19al呈相反的趋势。我们推断miR-107可能通过负调控NR5al和CYP19al特异性地参与雌激素的相关通路,而对AMH没有直接或者间接的调控作用。3.miR-92可直接调控ATRX和DDX3X的表达1).miRDB、Targetscan和miRecords三种不同的软件都预测出DDX3X和ATRX是miR-92的靶基因。我们利用DDX3X和ATRX3’-UTR双荧光素酶报告基因系统检测,初步确定DDX3X和ATRX是miR-92的两个靶基因。2).miR-92会显著抑制ATRX的表达水平,同时低水平的miR-92会上调ATRX的表达进而影响AMH水平,我们推测miR-92可能通过调靶向调控ATRX参与AMH相关通路来参与缪勒氏管的发育。3).miR-92会极显著的抑制DDX3X的表达量,转染miR-92 inhibitor,DDX3X的mRNA水平和蛋白水平的表达显著升高,我们推测miR-92通过靶向作用于DDX3X,参与鸡性分化早期。4).DDX3X和ATRX之间不存在调控关系,我们推测雄性高表达的miR-92可能通过调控不同的通路来参与雄性性腺的发育和分化。本研究表明,在E5.5存在许多差异表达的miRNAs,这些miRNAs可能通过调控不同的信号通路来参与早期鸡胚性腺的发育。此外,miR-107通过靶向作用NR5al来调控雌激素信号通路来参与雌性性腺的发育,miR-92可能通过靶向作用ATRX和DDX3X调控不同的通路来参与雄性性腺的发育。