论文部分内容阅读
肾纤维化（Renal Fibrosis,RF）是由多种慢性肾病发展而来的一种肾脏疾病进程,其发生预示肾功能的受损和恶化,肾小管上皮细胞细胞转分化（Epithelial-Mesenchymal Transition,EMT）是RF的重要原因之一。RF治疗费用昂贵,死亡率高,因此研究和发现有效治疗RF的药物迫在眉睫。丹酚酸B（Salvianolic acid B,SalB）是从中药丹参中提取出的高活性水溶性单体,在抗器官纤维化方面疗效确切。研究表明SalB能够激活体内的Sirt1蛋白。沉默信息调节因子1（Silent Information Regulator 1,Sirt1）是一种去乙酰化蛋白,在机体多种生理功能中起作用。在细胞自噬中,Sirt1通过去乙酰化相关蛋白从而激活自噬。自噬是存在于真核细胞中的一种保护机制,它能够清除细胞中受损细胞器和有害细胞因子,在RF的研究中,自噬可有效清除肾脏胶原沉积,缓减RF。基于此,本研究从Sirt1和自噬的机制入手,探究SalB对RF的药理作用和作用机制,以期为临床用药和基础实验提供新的思路。目的:1.制备阿霉素诱导的单侧肾切除大鼠RF模型,SalB给药治疗,研究SalB对纤维化大鼠肾脏的保护作用和其作用机制。2.建立TGF-β1诱导的HK-2细胞EMT模型,SalB干预治疗,探讨SalB对TGF-β1诱导的HK-2细胞保护作用和其作用机制。3.通过抑制或激活Sirt1以及自噬,探讨在SalB对TGF-β1诱导的HK-2细胞保护作用中Sirt1和自噬所扮演的角色。方法:1.SD大鼠单侧肾切除,分别在一周和一个月后尾静脉给予5mg·kg-1和3mg·kg-1阿霉素造模。造模结束后大鼠每天灌胃SalB高(200 mg·kg-1),中(100 mg·kg-1),低(50mg·kg-1)剂量干预治疗,使用贝那普利(1 mg·kg-1)作为阳性药对照,连续灌胃六周。每周检测大鼠24小时尿蛋白,通过对大鼠体内的血清肌酐（CRE）、血清尿素氮（UREA）、血清白蛋白（ALB）、血清总蛋白（TP）、血清甘油三酯（TC）、血清胆固醇（CHOL）含量的检测评价SalB对大鼠的肾功能保护作用,HE染色大鼠肾脏石蜡切片,分析SalB对大鼠病理改变的保护作用。通过蛋白免疫印迹法和免疫组化法检测大鼠肾脏组织的在RF中,转化生长因子（TGF-β）,α-平滑肌激动蛋白（α-SMA）,纤维连接蛋白（FN）,E-钙连蛋白（E-Cad）的含量从而评价SalB对RF大鼠肾脏内EMT的改善作用,检测大鼠肾脏组织微管相关蛋白1轻链3（LC3）、P62/SQSTMl（Sequestosomel）、雷帕霉素受体（mTOR）、Beclin1蛋白的含量评价SalB对RF大鼠自噬的作用,检测大鼠肾脏组织Sirt1蛋白的含量评价SalB对RF大鼠Sirt1的作用。2.建立TGF-β1诱导的HK-2细胞EMT模型,SalB干预治疗,通过观察细胞形态变化,检测细胞活力,细胞凋亡情况,评价探讨SalB对TGF-β1诱导的HK-2细胞的保护作用。通过迁移实验和蛋白免疫印迹法或免疫荧光法检测SalB干预治疗下TGF-β1诱导的HK-2细胞模型中FN、α-SMA、TGF-β、E-Cad的含量评价SalB对TGF-β1诱导的HK-2细胞EMT的改善作用,检测LC3、p62、mTOR、Beclin1蛋白的含量评价SalB对TGF-β1诱导的HK-2细胞自噬的作用,检测大鼠肾脏组织Sirt1蛋白的含量评价SalB对TGF-β1诱导的HK-2细胞Sirt1的作用。3.使用自噬激活剂雷帕霉素和抑制剂氯喹,Sirt1激活剂白藜芦醇和抑制剂烟酰胺分别共同诱导SalB干预治疗下TGF-β1诱导的HK-2细胞,通过检测EMT、自噬和Sirt1水平探讨自噬和Sirt1在SalB改善HK-2细胞EMT中的关键作用。结果:1.与RF大鼠模型组比较,SalB可有效降低大鼠24小时尿蛋白的含量,并且可以增高血清ALB、TP,降低血清CRE、UREA、CHOL、TC的含量,肾脏病理切片结果显示SalB能够改善RF大鼠肾脏病理损伤,减轻肾小管和肾小球的萎缩和坏死,提示SalB可改善RF大鼠的肾功能。SalB能够有效降低RF大鼠EMT水平,表现在与模型组相比FN、α-SMA、TGF-β蛋白含量显著降低、E-Cad蛋白含量显著升高;SalB能够促进肾脏自噬并且增高Sirt1含量,主要表现在与模型组相比SalB可升高肾组织LC3II/I的比值、Beclin1的表达、Sirt1蛋白的表达、降低肾组织mTOR和p62的表达。2.SalB可保护TGF-β1诱导的HK-2细胞的细胞形态受损,增加细胞活性,抑制细胞凋亡。SalB能够降低TGF-β1诱导的HK-2细胞EMT水平,抑制细胞迁移,降低FN、TGF-β、α-SMA蛋白含量,升高E-Cad蛋白含量;SalB能够促进TGF-β1诱导的HK-2细胞自噬并且增高Sirt1含量,与模型组相比SalB可升高肾组织LC3II/I的比值、Beclin1的表达、Sirt1蛋白的表达、降低肾组织mTOR和p62的表达。3.SalB对TGF-β1诱导的HK-2细胞EMT的抑制作用主要依赖于Sirt1和自噬的激活。SalB能够通过诱导Sirt1激活自噬并改善TGF-β1诱导的HK-2细胞EMT。结论:1.SalB能够保护RF大鼠肾功能、降低24小时尿蛋白含量、减轻RF大鼠肾脏病理损伤。SalB对RF大鼠的保护作用主要通过抑制肾脏EMT、促进肾脏自噬和Sirt1。2.SalB可保护TGF-β1诱导的HK-2细胞的细胞形态,增加细胞活性,抑制细胞凋亡。SalB对TGF-β1诱导的HK-2细胞的保护作用是通过减轻肾脏EMT、促进肾脏自噬和Sirt1。3.SalB能够通过诱导Sirt1激活自噬并改善TGF-β1诱导的HK-2细胞EMT。