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肝脏作为人体内以代谢功能为主的器官之一,在身体里发挥着许多作用,例如去氧化、储存肝糖、分泌性蛋白质的合成等。同时,它也极易受到例如酒精、化学物质及环境中的有毒物质等因素的攻击,诱发肝损伤,未得到及时治疗,则肝炎、肝硬化甚至肝癌的发生概率会加大。肝炎发生的早期病症即是急性肝损伤（acute liver injury,ALI）,其病情发展较急,严重者发生肝功能衰竭,发病过程中,肝组织有大量肝细胞的坏死和凋亡,肝炎的治疗对肝脏疾病的预防有着重要的作用,但其机制仍不明。天然免疫系统在肝损伤及炎症的发病过程中起着重要的作用,众多非免疫应答反应中都有机体固有免疫的NOD样受体家族成员参与,而作为NOD样受体家族成员之一的NLRC5（NLR family,CARD domain containing 5）,被证实可通过多个信号通路参与肝脏疾病的发生发展。本课题组前期在小鼠急性肝损伤模型研究中发现,腹腔巨噬细胞和LPS诱导的小鼠RAW 264.7细胞中NLRC5表达明显升高,且负调控IL-6、TNF-α等细胞因子的分泌,而另外,NLRC5也可在TNF-α诱导的LX-2细胞通过NF-κB信号通路正调控IL-6和IL-1β的表达。前期实验结果提示NLRC5参与了相关肝脏疾病的进程,但它在不同细胞中的功能机制不同。虽然目前已有大量关于急性肝损伤致病机制的研究,但目前仍未完全弄清楚。早期肝病是可控可逆的阶段,而对肝炎发生的预防与治疗阶段的研究已经成为人们研究的重中之重。在各种急慢性肝脏疾病中,导致肝功能异常的重要因素就是肝细胞凋亡。因此,本课题组通过建立实验性肝损伤动物模型,并构建了NLRC5基因肝脏特异性敲除小鼠,来研究NLRC5在肝细胞凋亡中的作用机制,这对于深入研究NLRC5在急性肝损伤中的表达变化和作用机制意义重大。此课题的研究内容主要包括以下5个部分:1. 野生型小鼠急性肝损伤模型的构建及NLRC5表达的检测选取8-10周龄的WT雄性小鼠（C57BL/6）进行小鼠急性肝损伤造模,实验首先检测CCl4诱导的小鼠急性肝损伤中肝组织NLRC5的表达情况。Western Blot,Real-time q PCR和免疫组化实验均证实NLRC5基因在小鼠急性肝损伤中的小鼠肝脏高表达。取小鼠血清进行AST/ALT指标及ELISA检测,收集肝组织进行HE染色,肝脏中的肝细胞经原位灌流分离,然后进行相关基因RT-q PCR以及Western Blot检测。2. 体内沉默NLRC5对CC14诱导的小鼠急性肝损伤的影响构建好沉默NLRC5腺相关病毒,由尾静脉注射到小鼠体内,肝脏感染4周后,利用CC14诱导小鼠急性肝损伤。通过HE染色,血清ALT和AST生化检测,ELISA检测在体沉默NLRC5对急性肝损伤的影响;通过Western blot和RT-q PCR检测在体沉默对凋亡蛋白Cleaved-caspase 3表达水平的影响;通过Caspase 3活性检测试剂盒检测肝组织中Caspase 3活性。实验结果发现,急性肝损伤过程中,在体沉默NLRC5可减少肝细胞凋亡,降低炎症因子浸润,从而减轻肝损伤程度。3. 肝脏条件性敲除NLRC5减轻CC14诱导的急性肝损伤采用CRISPR Cas9技术构建肝脏条件性敲除NLRC5基因雄性小鼠(NLRC5-/-),进行小鼠急性肝损伤造模,检测血清中ALT/AST水平及相关炎症因子水平,H&E染色。小鼠肝组织中NLRC5的蛋白表达及m RNA水平分别通过Western Blot和RT-q PCR检测;同时利用免疫组化及免疫荧光染色检测小鼠肝组织中NLRC5表达;最后,利用Caspase3活性检测试剂盒检测Caspase3的活性,结果表明,NLRC5的缺失可以显著减少CC14诱导的急性肝损伤中肝细胞的死亡,对肝脏发挥一定保护作用。4. 在AML-12细胞中沉默NLRC5对细胞凋亡的影响构建NLRC5小干扰RNA,转染进入细胞,然后用IFN-γ（10 ng/m L）诱导AML-12细胞凋亡。通过Western blot及RT-q PCR检测NLRC5的沉默效率以及其对凋亡蛋白（Bax,Bc1-2和Cleaved-caspase3）的表达变化的影响;利用Caspase3活性检测试剂盒检测AML-12细胞中Caspase3的活性;通过流式细胞术来检测沉默NLRC5对AML-12细胞凋亡的影响;结果表明:在AML-12细胞中沉默NLRC5可以抑制凋亡相关蛋白Bax和Cleaved-caspase 3的表达,升高Bc1-2的表达,与体内实验结果一致。5. 在AML-12细胞中过表达NLRC5对细胞凋亡的影响通过构建NLRC5过表达质粒,利用转染试剂lip2000转染进AML-12细胞,同样地,用IFN-γ（10 ng/m L）诱导AML-12细胞凋亡。通过Western blot及RT-q PCR检测NLRC5的过表达效率以及其对凋亡蛋白（Bax,Bc1-2和Cleaved-caspase3）的表达变化的影响;Caspase3活性检测试剂盒用来检测过表达NLRC5对AML-12细胞中Caspase3活性的影响;流式细胞术用来检测过表达NLRC5对AML-12凋亡的影响。结果显示:与沉默NLRC5相反,在AML-12细胞中过表达NLRC5可以升高凋亡相关蛋白Bax和Cleaved-caspase 3的表达,降低Bc1-2的表达。