精液冷冻保存与人工授精技术相结合，在现代畜牧业生产中发挥着巨大的作用。据美国农业部统计优质种公牛的精液冷冻和人工授精技术的大面积实施对美国奶牛群体遗传改良的贡献高达97%，使平均产奶量由过去的不到4吨到目前的9吨以上。但现阶段驴繁殖仍采用本交方式，国内外市场上未见驴冻精产品，国内外关于驴精液冷冻保存的研究报道也很少。驴繁殖技术的匮乏已成为制约驴产业发展的重要瓶颈。随着驴存栏量下降，作为阿胶主要原料的驴皮供应量随之而降。驴皮资源已成为制约阿胶行业发展的重要因素。德州驴是中国五大优良驴种之一，体格高大，结构匀称，外形美观，体型方正，头颈躯干结合良好，是改良小型驴种及作为种间杂交的理想品种。但目前德州驴纯种数量已不足千头，且品种质量严重退化，2006年已被农业部列为重点保护品种。本课题以德州驴为研究对象，通过研究脱脂奶、酪蛋白与酪蛋白酸钠在德州驴精液冷冻过程中的保护作用，SOD与CAT在卵黄稀释液中的抗氧化保护作用，研制出适合德州驴精液冷冻的新冻存液配方；通过季节、体尺、性行为等因素与精液冻后品质的关联分析，寻找影响驴精液冻后品质的因素，为德州驴精液高效冷冻生产奠定基础。一．脱脂奶、酪蛋白和酪蛋白酸钠在德州驴精液冷冻中的保护效果研究德州驴精液冻存时，稀释液中生物源性成分的减少能够保证稀释液的稳定性，有利于工业化生产；而且高甘油含量会刺激母驴，影响受胎率。本研究拟在低甘油含量（2.5%）条件下，筛选脱脂奶、酪蛋白和酪蛋白酸钠在精液稀释液中的适宜添加浓度。研究发现：在基础液中添加酪蛋白和酪蛋白酸钠浓度达到1%时，有一定保护作用，冻后平均活率达30.2%；当酪蛋白浓度添加至1.2%时，冻存效果显著提高，冻后活率达40.6%；继续增大酪蛋白浓度，冻后活率无显著变化（P＞0.05）。在此基础上，研究了1.2%酪蛋白和1%酪蛋白酸钠稀释液+脱脂奶（1:1比例混合）、1.4%酪蛋白和1%酪蛋白酸钠＋脱脂奶（1:1比例混合）对驴精液冷冻保护效果，发现1.4%酪蛋白和1%酪蛋白酸钠＋脱脂奶稀释液冻后活率43.6%，高于1.2%酪蛋白稀释液＋脱脂奶，但差异不显著（P＞0.05）。与本实验室前期研制的卵黄稀释液相比，酪蛋白稀释液冻后的精子膜完整性及顶体完整性两个指标显著高于卵黄稀释液，显示我们研制的酪蛋白稀释液对精子细胞膜和顶体具有较好的保护效果。后续人工授精结果显示：配种194头母驴三个情期受孕率63.9%，显示研制的酪蛋白稀释液可用于驴冻精生产。二．SOD与CAT对德州驴精液冷冻效果的影响精液冷冻过程中精子损伤主要有两种类型：氧化性损伤和物理性损伤。氧化性损伤主要由氧化应激引起，氧化应激是由活性氧（ROS）和抗氧化剂失衡所致。氧化性损伤会引起精子损伤、畸形甚至导致雄性不育，是影响受孕率的一个重要因素。很多研究者推测精液冷冻过程中反应氧过度产生及精子抗氧化能力的下降会增加精子损伤程度。本实验的主要目的是研究卵黄稀释液在冷冻保存德州驴精液过程中对酶及非酶抗氧化能力的影响。本实验测定了德州驴鲜精、卵黄稀释液、精液稀释后和冻后SOD、CAT、GSH-Px、T-AOC的活性，发现德州驴鲜精中三种酶的活性显著高于卵黄稀释液、离心稀释处理后精液和冷冻保存后精液（P＜0.01），但经离心稀释处理后的精液和冷冻保存后无明显变化（P＞0.05），卵黄稀释液中含量较低。卵黄稀释液能在一定程度上补偿因去除精清引起的抗氧化剂酶损失，但仍显著低于鲜精中抗氧化酶水平，因此在后续实验中设计了在卵黄稀释液中专门添加SOD、CAT的试验，旨在筛选SOD、CAT在卵黄稀释液中的最佳添加量。试验发现SOD和CAT最适添加浓度分别为300U/mL、400U/mL，经此稀释液冷冻保存的精液解冻后精子活率、膜完整性和线粒体活性显著提高。三．季节、体尺、性行为与德州驴精液冷冻效果的相关性分析公牛的体型外貌性状与繁殖性状间有一定的关联性，可通过外貌标记选择种公牛，但公驴的体型外貌性状是否与繁殖性状相关，国内外一直未见报道。本文研究目的是：①季节与精液冻后活率的关系，研究发情淡季种公驴采精、冻精的可行性；②季节与种公驴性行为的关系，为种公驴采精调教提供理论依据；③分析体重、体尺与冻精活率、采精量、密度、总精子数间的相关性，为种公驴选育提供理论指导；④性行为与冻精活率的关系，为种公驴采精时调教提供理论指导；⑤采精量与密度的关系，分析适合驴的采精频率，最大限度发挥种公驴的使用效率。结果显示：①五头驴中有4头公驴发情淡季和旺季精液冻后活率差无显著差异（P＞0.05）；②发情旺季与淡季相比，所有驴裂唇嗅次数和交配时间无显著差异，但勃起时间和爬跨次数存在差异；③体高与采精量显著相关（R=0.423，P＜0.05），体长（R=0.502）、阴囊周径（R=0.501）、管围（R=0.717）、尻长（R=0.748）与总精子数显著相关（P＜0.05，P＜0.01）。④爬跨次数、裂唇嗅次数、勃起时间、交配时间均与精液冻后活率不相关（R＜0.4，P＞0.05）。⑤采精量与密度呈负相关。上述结果显示优秀种公驴选择标准为体型高大匀称，睾丸发育良好；冻精活率与季节无相关性，驴精液冷冻生产可全年进行，但在发情淡季如冬季采精，需对种公驴进行适当调教；合适的采精频率是隔天采一次或每周采三次。