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周围神经损伤是一个世界性的临床问题,常由创伤或手术引起,可导致部分或全部的运动功能和感觉知觉丧失,甚至终身残疾。自体神经移植作为轴突再生理想的免疫惰性支架,被认为是治疗不可逆神经缺损的“金标准”。然而,自体神经移植受限于来源的缺乏、供体部位的高发病率、移植物与宿主神经的尺寸不匹配等。为了克服这些局限性,各种生物材料和种子细胞被用来制造人工神经支架,用于神经缺损的桥接,并取得了不同程度的成功。在这些方法中,有序纳米纤维构成的人工神经受到广泛关注,被认为能显著促进轴突的再生。另有研究表明,线形对干细胞的黏附、增殖、迁移和分化均有影响。施万细胞(Schwann cells,SCs)作为周围神经组织工程最有前途的种子细胞,可以合成和分泌多种神经营养因子和细胞外基质,引导和促进轴突的生长。此外,再生的轴突必须通过SCs再髓鞘化才能作为功能神经传导冲动。遗憾的是,SCs仅分布于周围神经,且属于高度分化、增殖能力低的成体细胞。采用传统的SCs分离方法存在供体神经来源困难及细胞扩增慢等问题,故难以获得足够的SCs以满足治疗需要。已有资料表明,骨髓间充质干细胞(Bone marrow derived mesenchymal stem cells,BMSCs)可诱导分化为施万样细胞,且排列整齐的纳米纤维可显著促进其分化,这说明微环境的拓扑结构在SCs分化中起着重要的作用。考虑到SCs与导电性轴突共存,我们推测导电性也可能会对BMSCs向SCs的分化过程产生影响,但是我们并没有找到相关的文献报道。为此,我们设计本课题对这一假设进行了验证:我们将导电材料-胺功能化的多壁碳纳米管(multi-walled carbon nanotubes,MWCNT)与聚己内酯(Polycaprolactone,PCL)和明胶(gelatin)共混,电纺成有序或无序导电纳米纤维,研究评价其对BMSCs向SCs分化的影响。然后利用大鼠坐骨神经缺损模型,研究以MWCNT/PCL/gelatin静电纺丝纤维为基础的人工神经导管对周围神经损伤后再生的影响。研究方法:1.以MWCNT,PCL及gelatin为原料,利用静电纺丝法,制备4种纳米纤维膜:无序纤维膜(random,R),有序纤维膜(aligned,A),无序导电纤维膜(random and conductive,RC),有序导电纤维膜(aligned andconductive,AC)。采用扫描电子显微镜对纳米纤维膜的表面形貌进行观察,利用Image J软件从图像中测量电纺纤维的直径,电化学工作站检测导电性,活死细胞染色评价纤维膜的生物相容性。2.体外分离培养BMSCs,并分别接种于4种纳米纤维膜或细胞培养板上,通过三个步骤向SCs诱导分化,通过免疫荧光染色、Western Blot验证诱导后的各组BMSCs(iBMSCs)表达SCs的特异性标记蛋白的差异。3.为检测iBMSCs对神经突生长的生物效应,体外分离培养背根神经节(DRG),与iBMSCs共培养5 d后,免疫荧光染色检测轴突的走向及长度的区别。4.制备PCL导管,将培养有iBMSCs的静电纺丝纤维膜填充进导管中,移植到SD大鼠坐骨神经10 mm缺损处,移植后12 w通过免疫荧光染色检测神经丝蛋白(Neurofilament,NF)及髓鞘碱性蛋白(myelin basic protein,MBP)的表达判断轴突再生及再髓鞘化的情况。通过腓肠肌湿重比,腓肠肌横截面的HE染色及神经电生理检测判断神经损伤后功能恢复及靶区肌组织修复情况。研究结果:1.材料的制备及表征:1.1采用静电纺丝技术制备了有序导电PCL/gelatin/MWCNT纳米纤维。作为对照,同时制备了无序导电的PCL/gelatin/MWCNT纳米纤维以及有序或无序不导电的PCL/明胶纳米纤维。扫描电子显微镜图像显示,这些纤维表面光滑,直径分布范围在200-900nm之间。1.2电化学工作站检测结果表明,与不导电纤维膜(R和A)相比,RC和AC纤维膜的导电性明显提高,说明MWCNT可以显著提高纳米纤维膜的导电性能。1.3活死细胞染色结果显示BMSCs在纤维膜上生长状态良好,与细胞培养板无显著差异,提示纤维膜具有良好的生物相容性。2.体外实验鉴定纤维膜对BMSCs向SCs诱导及对DRG神经突延伸的影响:2.1免疫荧光染色显示,向SCs方向定向诱导的BMSCs表达SCs的特异性标记物以及SCs的功能性蛋白S100,胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)及神经生长因子(nerve growth factor,NGF),Western blotting 和定量分析结果显示,所有诱导细胞的S100、GFAP和NGF水平均显著高于未诱导细胞。排列整齐的纳米纤维(A和AC)显著上调了 S100、GFAP和NGF的表达,而无序的纳米纤维(R和RC)与iBMSCs的表达水平相似。AC组水平高于A组,差异有统计学意义。2.1通过β微管蛋白Ⅲ(β-Tubulin Ⅲ,Tuj1)的免疫荧光染色检测DRG神经突的长度,结果说明在有序导电纤维膜上诱导的iBMSCs显著促进共培养DRG的神经突生长。3.体内实验检测含有序导电纤维膜的人工神经可促进坐骨神经损伤后修复:3.1免疫荧光染色结果证明,有序导电纤维膜上诱导的iBMSCs可以分化为成熟的SCs并参与髓鞘的形成;含有序导电纤维膜的人工神经导管显著促进坐骨神经损伤后的轴突再生及再髓鞘化。3.2电生理及腓肠肌横截面HE染色结果证明,含有序导电纤维膜的人工神经导管促进坐骨神经传导功能及其支配的靶肌肉的功能的恢复。研究结论:相对于无序纤维,有序纤维能有效促进BMSCs向SCs的诱导分化,在有序纳米纤维上赋予导电性可以显著增强SCs的分化效率,但是导电性对无序纤维的诱导分化并无明显的影响。此外,体内外实验结果均表明,有序导电纳米纤维可通过促进BMSCs分化为SCs,加速周围神经轴突的再生。总之,在有序纤维赋予导电性促进BMSCs向SCs分化,进而提高神经组织工程的治疗效果。