【摘 要】
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β-防御素Gallinacin-3（Gal 3）是鸡体内最重要的抗菌肽,除了具有直接的杀菌、抗病毒作用外,它还参与机体免疫反应,有重大的开发利用潜力。本文构建了表达鸡β-防御素的大肠杆菌系统、研究了重组鸡β-防御素在大肠杆菌系统中高水平表达规律和复性工艺,为规模化生产建立了技术基础。 本试验共分三部分:①鸡β-防御素的克隆 编码Gal 3的cDNA通过PCR法引入酶切位点,与pGEM-T载体
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β-防御素Gallinacin-3（Gal 3）是鸡体内最重要的抗菌肽,除了具有直接的杀菌、抗病毒作用外,它还参与机体免疫反应,有重大的开发利用潜力。本文构建了表达鸡β-防御素的大肠杆菌系统、研究了重组鸡β-防御素在大肠杆菌系统中高水平表达规律和复性工艺,为规模化生产建立了技术基础。 本试验共分三部分:①鸡β-防御素的克隆 编码Gal 3的cDNA通过PCR法引入酶切位点,与pGEM-T载体连接后再分别亚克隆至大肠杆菌表达载体pGEX6p-1、pQE30、pET30a和pET22b中,构建了表达Gal 3-GST融合蛋白和不同形式Gal 3-His融合蛋白的大肠杆菌表达系统。②重组鸡β-防御素在大肠杆菌中表达规律的研究 小量诱导试验表明,携带Gal 3-pGEX6p-1质粒的大肠杆菌于32kD左右出现一条新的蛋白质条带,而其它类型的重组菌不表达目的蛋白。融合蛋白的产量占细菌总蛋白的35%左右,主要以包涵体形式存在。加入诱导剂1h时,开始有可检出量重组蛋白质的表达,在2h时其表达水平已接近最大量;诱导剂IPTG在0.2-1.2mmol/ml范围内,对重组蛋白的产量没有明显影响。⑦重组鸡β-防御素的复性工艺研究将重组大肠杆菌经IPTG诱导所产生的包涵体用8mol/L尿素溶解后,分步稀释于含有氧化型谷胱甘肽和还原型谷胱甘肽的系统中进行复性。利用这一系统,约30%的重组蛋白质能得到完全复性。此外,重组鸡Gal3在12μg/ml时,能抑制肠炎沙门氏菌的生长,在24μg/ml时可抑制肠致病型大肠杆菌的生长。
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