铜是鱼类必需的微量元素之一,具有多种生理功能,但同时它也是一种重金属元素,过量会对鱼类产生毒副作用。目前的研究主要关注铜对鱼类生长性能、铜富集、组织结构病变以及氧化应激等方面的影响,而关于铜影响鱼类脂肪沉积及脂类代谢的研究报道极为缺乏。本文以矛尾复虾虎鱼和黄颡鱼为研究对象,首先克隆得到了一些脂类代谢相关基因的c DNA序列,并对其做了组织表达分析。然后,我们研究了水体铜暴露和饲料铜水平(缺乏和过量)对这两种鱼脂类代谢的影响及其机理。主要结果如下:1.黄颡鱼和矛尾复虾虎鱼脂类代谢基因的分子克隆及组织表达分析利用简并引物,采用RT-PCR和RACE技术从黄颡鱼中获得了两种激素敏感脂酶(HSL)基因的c DNA全长,命名为HSL1和HSL2。其长度分别为2739和2629bp,分别编码679和813个氨基酸,同源性为57.7%。进化分析结果表明,这两种HSL基因属旁系同源基因,可能产生于硬骨鱼类特有的基因组倍增事件。HSL1和HSL2在该鱼的各组织(肝脏、心脏、脾脏、肾脏、肌肉、鳃、肠道、脑和肠系膜脂肪组织)以及各发育阶段(稚鱼期、幼鱼期、亚成鱼期和成鱼期)均有表达,但呈现出不同的组织及发育表达模式,可能意味着它们具有不同的生理功能。利用简并引物和RT-PCR技术从矛尾复虾虎鱼中获得了15个脂类代谢相关基因的c DNA片段,包括G6PD、6PGD、ME、ICDH、FAS、ACCα、ACCβ、LPL、ATGL、HSL1、HSL2、CPT IA、SREBP-1、PPARα和PPARγ。这些基因与人、小鼠、爪蟾及斑马鱼的氨基酸同源性为54.6%~93.1%。进化分析进一步确定了这些基因并证明了矛尾复虾虎鱼的进化地位。所有这15个基因在矛尾复虾虎鱼的各组织(包括肝脏、肌肉、脾脏、脑、肠道、心脏及鳃)中均检测到,只是表达量有所差异。2.水体铜暴露对矛尾复虾虎鱼生长、铜富集及肝脏脂类代谢的影响为了研究水体铜暴露对矛尾复虾虎鱼生长、铜富集及脂类代谢的影响,将矛尾复虾虎鱼分别暴露于3个铜浓度(对照、57μg Cu/L和118μg Cu/L)的水体中30 d。结果显示,随着水体铜浓度的上升,矛尾复虾虎鱼生长性能下降,但肝体比(HSI)、脏体比(VSI)和肝脏脂肪含量均升高。油红O染色结果显示,铜暴露组鱼的肝脏呈现大量的脂肪变性。铜暴露增加了肝脏6PGD、G6PD和ME的活性,但对FAS、ICDH和CPT I的活性没有显著影响。此外,铜暴露增加了肝脏、鳃和胃肠道的铜含量,而对肌肉和脾脏没有显著影响。本研究证明了水体铜暴露能增强矛尾复虾虎鱼的脂类合成代谢,从而导致其肝脏脂肪沉积增加。3.水体铜暴露对黄颡鱼脂类代谢的影响为了研究水体铜暴露对黄颡鱼肝脏和脂肪组织中脂类代谢的影响及其机理,将黄颡鱼分别暴露于4个铜浓度(对照、24μg Cu/L、71μg Cu/L和118μg Cu/L)的水体中6周。结果显示,水体铜暴露对生长和形态学参数(肝体比、脏体比、脂体比和肥满度)有不利影响。在肝脏中,随着水体铜浓度的上升,脂肪含量、脂肪生成酶(6PGD、G6PD、ME、ICDH和FAS)的活性,以及6PGD、G6PD、FAS和SREBP-1基因的m RNA表达水平均降低,但LPL的活性及其m RNA表达水平升高。在脂肪组织中,水体高铜浓度下G6PD、ME和LPL的活性以及FAS、LPL和PPARγ基因的表达水平显著下降。此外,在肝脏和脂肪组织中,转录因子(SREBP-1和PPARγ)与脂肪生成酶的活性及其编码基因的m RNA表达水平呈现不同的皮尔森相关性。因此,本研究表明,铜暴露下肝脏和脂肪组织中脂肪含量的降低是由于脂肪生成酶的活性及其编码基因的表达水平下降引起的。肝脏和脂肪组织中这些酶和基因的不同反应表明了铜暴露下鱼类脂类代谢的调节具有组织特异性。4.水体铜暴露对黄颡鱼肉碱含量、肉碱棕榈酰转移酶I(CPT I)的动力学性质及其表达的影响为了进一步阐明水体铜暴露影响黄颡鱼脂类代谢的机理,将黄颡鱼分别暴露于4个铜浓度(对照、24μg Cu/L、71μg Cu/L和118μg Cu/L)的水体中6周后,分析对肝脏和肌肉组织中肉碱含量、CPT I的动力学性质及四种CPT I构型表达水平的影响。结果显示,铜暴露增加了肝脏的最大反应速率(Vmax)、米氏常数(Km)以及催化效率(Vmax/Km);在肌肉中,198μg Cu/L组的Vmax显著高于对照组,但Km和Vmax/Km在各处理组间没有显著差异。对于肉碱组成,在肝脏中,随着水体铜浓度的上升,总肉碱(TC)和脂酰肉碱(AC)的含量以及脂酰肉碱与游离肉碱的比值(AC/FC)升高,但游离肉碱(FC)的含量没有显著变化;在肌肉中,随着水体铜浓度的升高,FC的含量下降,但AC的含量上升,从而导致AC/FC升高。对于CPT I基因的表达,暴露于高铜浓度下(198μg Cu/L)显著上调了肝脏中CPT Iα1a、CPT Iα1b、CPT Iα2a,以及肌肉中CPT Iα1a、CPT Iα1b、CPT Iβ的表达水平。此外,CPT I基因的表达水平与肉碱的Km值及CPT I的活性呈现一定的相关性。因此,本研究表明,水体铜暴露通过改变肉碱组成、CPT I动力学性质及不同CPT I亚型的表达水平从而影响了CPT I的活性,进而影响黄颡鱼的脂类代谢和脂肪沉积。5.饲料铜缺乏和过量对黄颡鱼脂类代谢的影响为了研究饲料铜缺乏和过量对黄颡鱼肝脏、肌肉和脂肪组织脂类代谢的影响及其机理,黄颡鱼分别饲喂铜含量为0.76(铜缺乏)、4.18(适量铜)和92.45(铜过量)mg/kg的饲料8周。结果显示,适量铜组鱼的增重率和特定生长率显著高于铜缺乏和铜过量组。在肝脏中,铜缺乏对铜富集和脂肪含量、脂肪生成酶(6PGD、G6PD和FAS)的活性,以及6PGD、G6PD、FAS、ACCα、PPARγ、LXR、HSL、PPARα和ATGL的m RNA表达水平没有显著影响;但铜过量增加了铜富集、降低了脂肪含量、抑制了FAS的活性,并下调了6PGD、G6PD、FAS、ACCα、PPARγ、HSL和ATGL的表达水平。在肌肉中,饲料铜水平对脂肪含量、脂肪生成酶的活性及大多数检测基因(6PGD、G6PD、FAS、SREBP-1、PPARγ、HSL和LPL)的表达水平没有显著影响。在脂肪组织中,饲料铜缺乏和过量对铜富集和脂肪含量、FAS的活性,以及6PGD、G6PD、FAS、SREBP-1、LXR、PPARα和LPL的表达水平均没有显著影响。因此,本实验表明组织中脂肪含量的改变跟脂类代谢酶的活性及相关基因表达水平密切相关。饲料铜水平差异性地影响了肝脏、肌肉和脂肪组织中脂肪生成酶的活性及相关基因的表达水平,表明不同饲料铜水平下鱼类脂类代谢的调节具有组织特异性。6.饲料铜缺乏和过量对黄颡鱼肉碱含量、肉碱棕榈酰转移酶I(CPT I)的动力学性质及其表达的影响为了进一步阐明饲料铜缺乏和过量影响黄颡鱼脂类代谢的机理,黄颡鱼分别投喂铜含量为0.76(铜缺乏)、4.18(适量铜)和92.45(铜过量)mg/kg的饲料8周后,分析对肝脏和肌肉组织中肉碱含量、CPT I的动力学性质及四种CPT I构型表达水平的影响。结果显示,在肝脏中,铜缺乏对FC、TC和AC的含量及AC/FC值没有显著影响;但铜过量降低了FC、TC和AC的含量及AC/FC值。在肌肉中,饲料铜缺乏和过量对FC、TC和AC的含量没有显著影响,但铜过量增加了AC/FC值。与适量铜组相比,铜缺乏对肝脏和肌肉的Vmax、Km以及Vmax/Km都没有显著影响;但是,铜过量组肝脏的Vmax和Vmax/Km显著降低,而肌肉的Vmax显著升高。饲料铜含量也影响了肝脏和肌肉中四种CPT I亚型(CPT Iα1a、CPT Iα1b、CPT Iα2a和CPT Iβ)的表达水平。此外,CPT I基因的表达水平与肉碱的Km值及CPT I的活性呈现一定的相关性。因此,本研究表明饲料铜缺乏和过量差异性地影响了黄颡鱼肝脏和肌肉组织的肉碱状态、CPT I动力学性质及其表达水平,从而影响黄颡鱼的脂肪沉积和脂类代谢。