【摘 要】
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目的:随着基因测序技术的发展,目前已检出1000多种苯丙氨酸羟化酶（Phenylalanine hydroxylase,PAH）基因突变。采用体外表达的方法研究新发现的PAH基因突变的表型及其功能是PKU（Phenylketonuria,PKU）研究的一个热点内容。通过构建PAH基因突变体的体外真核表达体系可以正确区分突变的性质,评价突变对PAH蛋白功能的影响程度,明确突变对PKU的致病机制。我们
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目的:随着基因测序技术的发展,目前已检出1000多种苯丙氨酸羟化酶（Phenylalanine hydroxylase,PAH）基因突变。采用体外表达的方法研究新发现的PAH基因突变的表型及其功能是PKU（Phenylketonuria,PKU）研究的一个热点内容。通过构建PAH基因突变体的体外真核表达体系可以正确区分突变的性质,评价突变对PAH蛋白功能的影响程度,明确突变对PKU的致病机制。我们通过采用体外细胞模型构建,对前期临床工作中发现的三种PAH基因新发突变进行表型研究,鉴定突变对酶功能的影响,为三种基因突变的功能预测提供了遗传学基础数据。方法:本研究首先采用生物信息学方法对我们前期临床工作中发现的三种PAH基因突变c.[59A>C;60G>C]（Q20P）,c.690-691ins G（S231fx X51）,c.1119-1120ins T（I374fx X20）进行突变后三级结构的预测。其次以正常表达PAH基因的非洲绿猴肾细胞COS-1细胞系为材料,采用CRISPR/Cas9基因编辑技术,针对上述的三种突变分别构建PAH体外稳定表达突变株,并对其进行功能验证,分别检测其m RNA、酶蛋白量、酶活性的变化,并结合生物信息学预测结果揭示三种PAH基因突变后的分子遗传学机制。结果:（1）通过生物信息学结构预测软件SWISS-MODEL预测了三种PAH基因突变后其所在外显子三维结构的变化。生物信息学对帮助预测基因突变的表型有一定帮助,但其准确性仍无法保证,有进一步提升的空间。（2）通过CRISPR/Cas9基因编辑技术成功构建了三种PAH基因新发突变的稳定细胞株。（3）通过RT-PCR检测突变株的m RNA表达情况,c.[59A>C;60G>C]（Q20P）的m RNA水平较野生型无明显变化,为野生型的95.4%。c.690-691ins G（S231fx X51）和c.1119-1120ins T（I374fx X20）的m RNA表达量分别为野生型的87.2%和82.6%,其表达差异有统计学意义（*P<0.05）。（4）通过Western Blot实验检测突变株的蛋白表达量,相较于野生型PAH,c.[59A>C;60G>C]（Q20P）的蛋白表达量为野生性的81.17%,c.690-691ins G（S231fx X51）的蛋白表达量为野生性的65.24%,c.1119-1120ins T（I374fx X20）的蛋白表达量为野生性的50.57%,其表达差异有统计学意义（*P<0.05）。（5）通过酶活性检测发现相较于野生型PAH,错义突变c.[59A>C;60G>C]（Q20P）的体外表达残余酶活性为57.3%,插入突变c.690-691ins G（S231fx X51）的的体外表达残余酶活性为22.8%,插入突变c.1119-1120ins T（I374fx X20）的的体外表达残余酶活性为20.3%,其表达差异有统计学意义（*P<0.05）。结论:（1）通过CRISPR/Cas9基因编辑方法成功构建了三种PAH基因突变c.[59A>C;60G>C]（Q20P）、c.690-691ins G（S231fx X51）、c.1119-1120ins T（I374fx X20）的稳定突变细胞模型。（2）对突变细胞株酶活性检测的结果表明,三种突变的体外表达酶活性均明显降低,残留酶活性分别为野生型的53.7%,22.8%,20.3%。突变c.[59A>C;60G>C]（Q20P）对PAH基因m RNA和PAH蛋白表达量影响较小。c.[59A>C;60G>C]（Q20P）突变体PAH酶活性则受到较大影响。而c.690-691ins G（S231fx X51）和c.1119-1120ins T（I374fx X20）突变对PAH蛋白的三维结构和酶活性的影响更为显著。（3）c.[59A>C;60G>C]（Q20P）突变导致酶活性降低的原因可能是突变导致PAH蛋白错误折叠或者形成的蛋白三维结构并不稳定导致其水解。而c.690-691ins G（S231fx X51）和c.1119-1120ins T（I374fx X20）突变后酶活性降低的原因则是突变后蛋白结构不完整进而影响其蛋白的表达以及酶活性的降低。（4）生物信息学方法对蛋白三维结构的预测分析结合PAH基因的体外表达研究可以更加深刻的理解PAH基因突变的分子机制。
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