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目的本课题研究将对已确定对自杀基因系统具有协同增效作用的白藜芦醇这一中药活性成份进行研究,探究其如何通过缝隙连接细胞通讯增强自杀基因的旁杀伤效应,为建立中医药治疗肿瘤,推进抗癌中药新药和肿瘤基因治疗的临床应用打下基础。方法本实验以体外培养的大鼠肝癌细胞CBRH7919, CBRH7919TK,小鼠恶性黑色素瘤B16-RFP, B16/TK-GFP作为研究对象。大鼠肝癌自杀基因系统运用MTT法检测白藜芦醇对其的增效作用,确定作用时间及药物浓度；Western Blot检测白藜芦醇对缝隙连接蛋白,其中包括Cx26、Cx32和Cx43表达的影响；用裸小鼠体内实验验证白藜芦醇对大鼠肝癌自杀基因系统的增效作用。小鼠恶性黑色素瘤自杀基因(带绿色荧光)细胞运用MTT法检测白藜芦醇对其的协同增效作用,确定作用时间及药物浓度；流式细胞仪技术检测白藜芦醇对其凋亡作用影响；Western Blot法检测白藜芦醇对缝隙连接蛋白,其中包括Cx26、Cx32和Cx43表达的影响；成果一、白藜芦醇对小鼠恶性黑色素瘤自杀基因系统的增效作用(一)白藜芦醇对30%B16tk-GFP/GCV的增效作用用4μmol/L、8μmol/L、16μmol/L、32μmol/L的白藜芦醇作用30%B16/TK-GFP细胞72h后,其细胞抑制率分别为-3.43±3.03%,-1.88±1.29%、26.65±1.87%、36.95±3.23%；4μmol/L、8μmol/L、16μmol/L、32μmol/L的白藜芦醇联合作用30%B16TK-GFP/GCV细胞72h后,其细胞抑制率分别为43.32±3.93%、47.00±4.13%、53.74±4.61%、55.76±3.83%,金氏Q值分别是1.98、2.04、1.21、1.06,除了32μmol/L与30%B16TK-GFP/GCV联合属于相加效应之外,其他浓度均为协同效应。(二)用流式细胞仪检测白藜芦醇对30%B16/TK-GFP的凋亡作用白藜芦醇单药作用于30%B16/TK-GFP时,亚倍体凋亡峰Sub-G1峰由细胞对照的3.00%增加到4.15%,5.26%,6.96%,白藜芦醇16μmol/L时与对照组相比,P<0.05,有显著性差异。联合GCV后,亚倍体凋亡峰即Sub-G1峰由单独GCV作用的6.63%增加到8.96%,11.32%,15.24%,白藜芦醇8μmol/L,16μmol/L时与GCV组相比,P<0.01,有显著性差异,与对应浓度的Res组相比P<0.01,有显著性差异。计算金氏Q值后,Q值都大于1.15,具有协同作用。可以看出,白藜芦醇与GCV联合作用于自杀基因时,其具有一定的协同作用。(三) Western Blot检测白藜芦醇对B16-RFP细胞株中Cx26、Cx32和Cx43缝隙蛋白表达的影响白藜芦醇作用B16-RFP细胞48h后检测Cx26蛋白有升高的趋势；Cx32蛋白表达统计无显著性差异；Cx43蛋白升高的趋势。二、白藜芦醇对大鼠肝癌自杀基因系统的增效作用(一)白藜芦醇对20%CBRH7919TK/GCV的增效作用用2.5μmol/L、5μmol/L、10μmol/L、20μmol/L、40μmol/L、的白藜芦醇作用20%CBRH7919tk细胞48h后,其细胞抑制率分别为-0.43±1.77%,-0.85±0.58%、0.64±1.00%、9.75±1.45%、12.63±2.17%;2μmol/L、5μmol/L、10μmol/L、20μmol/L、40μmol/L的白藜芦醇联合作用20%CBRH7919TK/GCV细胞48h后,其细胞抑制率分别为13.43±1.66%、14.02±1.92%、19.40±3.61%、24.15±2.84%、21.37±2.69%,金氏Q值分别是1.31、1.56、1.87、1.29、1.01。除了40μmol/L与20%CBRH7919TK/GCV联合属于相加效应之外,其他浓度均为协同效应。(二) Western Blot检测白藜芦醇对CBRH7919细胞株中Cx26、Cx32和Cx43缝隙蛋白表达的影响白藜芦醇作用48h后检测CBRH7919细胞Cx26蛋白的表达是呈上升的趋势；Cx32蛋白的表达有上升的趋势；Cx43蛋白表达有上升趋势。(三)白藜芦醇在体内联合50%TK/GCV系统对CBRH7919的增效作用白藜芦醇100mg/kg肿瘤质量比模型组大、白藜芦醇150mg/kg组的肿瘤质量比模型组小,两对均没有统计学意义(P>0.05)；白藜芦醇100mg/kg联合GCV组、白藜芦醇150mg/kg联合GCV组和GCV组与模型组比较有统计学意义(P<0.05)；白藜芦醇100mg/kg联合GCV组与GCV组相比无统计学意义(P>0.05),白藜芦醇150mg/kg联合GCV组与GCV组比较有统计学意义(P<0.05)；联合组与对应浓度白藜芦醇组相比较有统计学意义(P<0.05)。结论本文在前期实验的基础上,用中药活成分白藜芦醇对小鼠恶性黑色素瘤和大鼠肝癌这两个自杀基因系统进一步探讨,发现白藜芦醇可以提高自杀基因系统的增效作用,通过调节缝隙连接蛋白,来增强GJIC的功能。