论文部分内容阅读
花青素是自然界一类广泛存在于植物中的水溶性天然色素,属于黄酮类的次生代谢物。花青素具有较强的抗氧化特性,其在植物抵抗生物和非生物逆境以及人类延缓衰老、癌症治疗等健康领域中具有重要作用。甘蓝型油菜（Brassica napus L.,2n=38）中富含花青素的种质资源缺乏,有关花青素合成基因的报道较少。利用芸薹属近缘种转录组测序研究花青素转录调控及通过远缘杂交创建富含花青素的甘蓝型油菜新资源、进行花青素相关基因的克隆及功能解析,对油菜的多功能利用具有重要意义。本实验室在小白菜（B.rapa L.ssp.chinesis）、诸葛菜（Orychophragmus violaceus（L.）O.E.Schulz）和甘蓝型油菜的复合杂交后代中选育出表型为紫色植株的甘蓝型油菜渗入系,命名为紫色油菜（Purple rapeseed,PR）。本研究解析了调控PR叶片花青素合成关键基因Bna PAP2.A7的表达特性及其不同转录本的功能,精细定位并克隆了紫秆性状的基因Bna PAP2.C6.a,并对上述基因的同源性、进化关系和在PR不同组织部位表达模式进行了分析。同时,本实验室收集了紫罗兰（Matthiola incana L.）和桂竹香（Erysimum cheiri L.）不同花色材料的高代自交系,利用转录组测序和代谢组分析了紫罗兰和桂竹香不同颜色花瓣中花青素的主要类型及其合成相关基因的表达。主要结果如下:1. PR叶片紫色形成关键基因的鉴定与表达分析中双11（ZS11）与PR叶片比较转录组分析表明,与拟南芥At PAP2同源的Bna PAP2.A7（Bna A07g25800D）可能是调控紫叶性状的关键基因,并具有三种转录本。Bna PAP2.A7的序列分离与比较分析表明,PR中Bna PAP2.A7分别在启动子区域的-611bp位置有TC碱基和-1339bp位置有T碱基的插入,ZS11和Jia9709的Bna PAP2.A7在启动子区域序列相同,推测可能是这两处碱基插入激活了PR Bna PAP2.A7的表达;q RT-PCR分析表明,Bna PAP2.A7在PR叶片中表达显著高于ZS11,且其表达受紫外线诱导,并与紫色表型密切相关。这些结果进一步说明Bna PAP2.A7为PR紫叶形成的关键基因。2. Bna PAP2.A7及其三种转录本的功能分析Bna PAP2.A7的三个转录本（长度分别为910 bp,744 bp和395 bp）的表达丰度具有744>395>910的关系,其中744 bp转录本为正常剪接产物,编码蛋白具有完整的R2、R3与C端结构域,但是另外两个转录本编码的蛋白缺少部分R3与C端结构域;亚细胞定位发现三种蛋白均定位于细胞核,但酵母双杂交分析表明只有744 bp转录本编码的蛋白可以与At TT8蛋白互作。利用已有的转基因油菜T2植株,进行了q RT-PCR、转录组和代谢物分析。结果表明,Bna PAP2.A7全长基因能够显著上调花青素晚期合成基因的表达,从而促进受体植株叶片紫色的产生,但是910 bp和与395 bp转录本则抑制花青素的合成早期基因表达,转基因植株各组织无明显紫色产生。这说明Bna PAP2.A7三个转录本中,只有744 bp转录本可以促进叶片花青素的产生,而另外两个转录本则抑制花青素的合成,这与蛋白互作分析结果是一致的。3. PR紫杆性状的精细定位及候选基因分析利用小孢子培养纯化的PR与ZS11正反交获得杂种F1,自交获得F2群体。F2群体紫色茎秆与绿色茎秆植株分别为275:95,比例符合3:1（?2=0.130）,说明紫秆性状受单基因控制,且不存在细胞质效应。利用F2群体中的极端单株进行Bulked Segregant Analysis（BSA）分析,将控制紫杆性状的基因定位于C6染色体27-28.6 M区间内;利用该区间内开发的In Del标记,对F2分离群体（>2万株）中的隐性单株（5254株）进行标记分析,进一步将其定位在C6染色体约18.6 kb的区间内（以Darmor-bzh为参考）,对应到ZS11与NY7的基因组区间长度分别为293 kb和284 kb。Darmor-bzh基因组目标区间未发现与花青素合成相关的基因,而在ZS11和NY7目标区间内均发现了3个At PAP2同源的基因:Bna PAP2.C6.a,Bna PAP2.C6.b和Bna PAP2.C6.c。转录组测序和q RT-PCR分析发现,Bna PAP2.C6.c和Bna PAP2.C6.b在ZS11和PR中不表达,而Bna PAP2.C6.a只在PR中表达。因此,推测Bna PAP2.C6.a是控制PR紫秆性状的关键基因。4. 甘蓝型油菜PAP2同源基因的鉴定、系统进化与表达分析甘蓝型油菜参考基因组（Darmor-bzh）中共有8个拟南芥PAP2的同源基因,分别位于A2（Bna PAP2.A2）、A3（Bna PAP2.A3）、A7（Bna PAP2.A7）、C2（Bna PAP2.C2）、C3（Bna PAP2.C3）和C6染色体（3个串联重复基因:Bna PAP2.C6.a,Bna PAP2.C6.b,Bna PAP2.C6.c）,而最新释放的宁油7号（NY7）和中双11（ZS11）参考基因组则有9个PAP2的同源基因。微共线性分析发现,多出的一个拷贝与Bna PAP2.A7呈现串联重复关系,因此分别命名为Bna PAP2.A7A7.a与Bna PAP2.A7A7.b。进一步分析发现,甘蓝型油菜基因组中Bna PAP2.C6.a与Bna PAP2.C6.b分别为甘蓝参考基因组对应区段内Bo PAP2.C6.a与Bo PAP2.C6.b的直系同源基因,而Bna PAP2.C6.c则为甘蓝型油菜形成之后由Bna PAP2.C6.a通过串联重复形成的另一拷贝。Bna PAP2.A7.a为白菜参考基因组对应区段内Br PAP2.A7的直系同源基因,而Bna PAP2.A7.b则为A7与C6染色体间部分同源交换形成的Bna PAP2.C6.b的另一拷贝。分别选取PR的叶片、茎秆、花和幼嫩角果皮进行转录组测序分析。结果表明,在PR有花青素积累的组织（叶片、茎秆和角果）中Bna PAP2.C6.a,Bna PAP2.A7.a和Bna PAP2.C2均有较高水平表达,而其他拷贝基本不表达,但在花瓣中几乎所有拷贝均不表达。另外,Bna PAP2.A7.a在叶片中表达量最高,Bna PAP2.C6.a在茎秆和角果皮中表达量最高。这些结果表明,Bna PAP2.A7.a主要调控PR叶片花青素的合成,而Bna PAP2.C6.a主要调控PR茎秆和角果皮花青素的合成。5. 油菜近缘种（桂竹香和紫罗兰）花瓣转录组与代谢组分析桂竹香黄色和橘红色花瓣比较转录组分析表明,花青素代谢通路几乎所有后期结构基因和转录因子均上调表达,推测PAP2同源基因可能也是调控橘红色花瓣形成的关键基因。在白色和玫红色花瓣之间的比较中,五个差异表达基因中的四个基因（CHS,F3H,ANS和MYB4）在玫红色花瓣中表达更高。但是紫罗兰白色和淡紫色比较转录组分析没有发现花色苷合成通路晚期合成基因间存在差异表达,且所有差异表达的基因在白色中的表达都比浅紫色花瓣中的高得多。推测紫罗兰花色的变异可能除了受花青素合成相关基因的转录调控外,还与细胞p H值等细胞环境有关。代谢组分析发现以白色为对照,黄色可以单独聚类,淡紫色、紫色、橘红色、粉红色可以聚为一类,深紫色和玫红色可以聚为一类,鉴定到了一些已知分子量的花青素类代谢物。综上所述,紫色甘蓝型油菜渗入系PR的紫叶与紫秆性状分别由Bna PAP2.A7.a以及Bna PAP2.C6.a调控,二者分别为甘蓝型油菜祖先种白菜和甘蓝基因组对应染色体区段内Br PAP2.A7和Bo PAP2.C6.a的直系同源基因。油菜近缘种（桂竹香与紫罗兰）)花瓣颜色的变异除受花青素合成途径相关基因调控外,可能还受到花瓣细胞p H值等因素的影响。