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第一部分：孕期酒精暴露导致胎鼠组蛋白高乙酰化引起心脏发育相关基因过表达目的通过对孕鼠经胃管服用酒精构建孕期酒精暴露的模型,检测酒精对乙酰化组蛋白H3表达与胎鼠心脏发育相关基因GATA4、NKX2.5、 DHAND和EHAND表达及其启动子区域乙酰化组蛋白H3水平的影响。以此证实孕期酒精暴露可以引起胎鼠心脏组织组蛋白H3高乙酰化,进而引起心脏发育相关基因的过表达。方法1)建模：孕鼠在E7.5利用筛选剂量开始灌服56%酒精,在E14.5天收集胎鼠心脏标本,分别提取核蛋白及RNA,编号保存进行下一步实验。2)分组：分为空白对照组(Blank组),酒精组(Alc组)及阴性对照组(DMSO组)。3)检测指标及方法：比色法测定孕期酒精暴露后胎鼠心脏组织组蛋白4)乙酰化酶(HATs)的活性；Western免疫印迹(Western Blotting)法测定其组蛋白H3乙酰化的表达水平;实时荧光定量PCR (RT-Q-PCR)法测定胎鼠心脏的发育相关基因GATA4, NKX2.5, DHAND和EHAND表达量,以及染色质免疫共沉淀(ChIP)及RT-Q-PCR法测定上述的心脏发育相关特异基因启动子区乙酰化组蛋白H3(AcH3)的水平。结果1)孕期酒精暴露在E14.5时引起HATs酶活性明显增高(P<0.05)。2)A1c组乙酰化组蛋白H3水平与Blank组及DMSO组相比,E14.5时表达量分别较两组显著升高(P<0.05)。3)Alc组心脏发育相关基因GATA4, NKX2.5, DHAND和EHAND的mRNA水平与Blank组及DMSO组相比,E14.5时各基因的mRNA表达量分别较两组显著升高(P<0.05)。4)A1c组心脏发育相关基因GATA4, NKX2.5, DHAND和EHAND启动子区的AcH3水平与Blank组及DMSO组相比,E14.5时各基因的AcH3水平分别较两组显著升高(P<0.05)。结论11孕期酒精暴露引起胎鼠心脏组织HATs酶活性升高。2)孕期酒精暴露致胎鼠心脏组织的组蛋白H3乙酰化水平升高,使AcH3表达增加。3)孕期酒精暴露致胎鼠心脏发育相关基因GATA4, NKX2.5, DHAND和EHAND的过表达。4)孕期酒精暴露致胎鼠心脏发育相关基因GATA4, NKX2.5, DHAND和EHAND启动子区的AcH3的水平显著增加。第二部分：Curcumin下调组蛋白乙酰化水平逆转孕期酒精暴露导致心脏发育相关基因过表达目的在孕期酒精暴露的基础上,给孕鼠同时腹腔注射HATs酶抑制剂Curcumin降低心脏组织的组蛋白H3乙酰化水平,观察胎鼠心脏发育相关基因的表达水平,探讨其能否逆转孕期酒精暴露所引起的组蛋白H3高乙酰化导致的心脏相关基因的过表达。方法1)建模：孕鼠在E7.5利用筛选剂量开始腹腔注射Curcumin,同日灌服56%酒精,在E14.5天收集胎鼠心脏标本,分别提取核蛋白及RNA,编号保存以进行下一步实验。2)分组：分为空白对照组(Blank组),酒精组(Alc组),阴性对照组(DMSO组),Curcumin组(Cur组)及Curcumin和酒精组(Alc和Cur组)。3)检测指标及方法：比色法测定以上各组胎鼠心脏组织HATs酶的活性；Western Blotting法测定其组蛋白H3乙酰化的表达水平；RT-Q-PCR法测定胎鼠心脏的发育相关基因GATA4, NKX2.5, DHAND和EHAND表达量,以及ChIP-RT-Q-PCR法测定上述的心脏发育相关基因启动子区AcH3的水平。结果1)Cur组HATs酶活性在E14.5明显低于各实验组(P<0.05),A1c和Cur组HATs酶活性和Blank组及DMSO组无显著差异(P>0.05)。2)Cur组乙酰化组蛋白H3水平E14.5明显低于各实验组(P<0.05),Alc和Cur组乙酰化组蛋白H3水平和Blank组及DMSO组无显著差异(P>0.05)。3)Cur组心脏发育相关基因GATA4, NKX2.5, DHAND和EHAND的mRNA水平明显低于各实验组(P<0.05),A1c和Cur组心脏发育相关基因GATA4, Nkx2.5, DHAND和EHAND的mRNA水平和Blank组及DMSO组无显著差异(P>0.05)。4)Cur组心脏发育相关基因GATA4, NKX2.5, DHAND和EHAND启动子区的AcH3水平明显低于各实验组(P<0.05),Alc和Cur组心脏发育相关基因GATA4, NKX2.5, DHAND和EHAND启动子区的AcH3水平和Blank组及DMSO组无显著差异(P>0.05)。结论1) Curcumin能够逆转孕期酒精暴露引起的HATs酶活性升高。2) Curcumin可以逆转孕期酒精暴露引起的组蛋白H3乙酰化水平升高,致使AcH3表达基本正常。3) Curcumin能够逆转孕期酒精暴露所导致的基因GATA4, NKX2.5, DHAND和EHAND的过表达,使表达量恢复到接近正常水平。4) Curcumin可以逆转孕期酒精暴露所致GATA4, NKX2.5, DHAND和EHAND启动子区AcH3的高表达。第三部分SAHA上调组蛋白乙酰化水平加重孕期酒精暴露导致心脏特异发育相关基因过表达目的在孕期酒精暴露的基础上,给孕鼠同时腹腔注射HDACs酶抑制剂SAHA提高心脏组织的组蛋白H3乙酰化水平,观察胎鼠心脏相关发育相关基因的表达水平,探讨其能否加重孕期酒精暴露所引起的组蛋白H3高乙酰化导致的心脏相关基因的过表达。方法1)建模：孕鼠在E7.5利用筛选剂量开始腹腔注射SAHA,同日灌服56%酒精,在E14.5天收集胎鼠心脏标本,分别提取核蛋白及RNA,编号保存以进行下一步实验。2)分组：分为空白对照组(Blank组),酒精组(Alc组),阴性对照组(DMSO组),SAHA组及SAHA和酒精组(Alc和SAHA组)。3)检测指标及方法：比色法测定以上各组胎鼠心脏组织的HATs酶活性；Western Blotting法测定组蛋白H3乙酰化的表达水平；RT-Q-PCR法测定胎鼠心脏的发育相关基因GATA4, NKX2.5, DHAND和EHAND表达量,以及ChIP-RT-Q-PCR法测定上述的心脏发育相关基因启动‘子区AcH3的水平。结果1)Alc和SAHA组HATs酶活性在E14.5明显高于各实验组(P<0.05),SAHA组HATs酶活性和Alc组相比无显著差异(P>0.05)。2)A1 c和SAHA组乙酰化组蛋白H3水平E14.5明显高于各实验组(P<0.05),SAHA组乙酰化组蛋白H3水平和A1c组相比无显著差异(P>0.05)。3)Alc和SAHA组心脏发育相关基因GATA4, NKX2.5, DHAND和EHAND的mRNA水平明显高于各实验组(P<0.05),SAHA组心脏发育相关基因GATA4, NKX2.5, DHAND和EHAND的mRNA水平和Alc组相比无显著差异(P>0.05)。4)A1c和SAHA组心脏发育相关基因GATA4, NKX2.5, DHAND和EHAND启动子区的AcH3水平明显高于各实验组(P<0.05),SAHA组心脏发育相关基因GATA4, NKX2.5, DHAND和EHAND启动子区的AcH3水平和Alc组相比无显著差异(P>0.05)。结论1) SAHA能够促进孕期酒精暴露引起的HATs酶活性升高。2) SAHA能够促进孕期酒精暴露引起的组蛋白H3乙酰化水平进一步升高,加重AcH3表达基本异常。3) SAHA能够加重孕期酒精暴露所导致的基因GATA4, NKX2.5, DHAND和EHAND的过表达,其表达量较单纯孕期酒精暴露进一步增加。4) SAHA能够进一步加重孕期酒精暴露所致的基因GATA4, NKX2.5, DHAND和EHAND启动子区的AcH3的表达水平,使其启动子区的AeH3结合量明显增多。第四部分JNK信号通路介导酒精致H9C2心肌细胞组蛋白H3乙酰化上调引起心脏发育相关基因过表达目的H9C2心肌细胞在酒精干预的基础上,予以JNK信号通路的特异性抑制剂SP600125阻断其信号传导,观察其对下游心脏发育相关基因及乙酰化水平的影响,探讨JNK信号通路是否参与孕期酒精暴露所引起的组蛋白H3高乙酰化导致的心脏发育相关基因的表达异常,以此验证JNK信号通路介导酒精暴露引起H9C2细胞组蛋白H3高乙酰化导致心脏发育相关基因的过表达通路的上游信号。方法1)剂量筛选：根据实验室前期研究筛选出的酒精剂量处理H9C2细胞36小时后,加入不同浓度的SP600125阻断JNK通路,采用MTT法测定各组的细胞生存率,筛选出SP600125的最适剂量。2)分组：分为空白对照组(Blank组),酒精组(Alc组),阴性对照组(DMSO组),SP组及酒精和SP组(A1c和SP组)。3)检测指标及方法：比色法测定以上各组H9C2细胞的HATs酶活性；Western Blotting法测定其组蛋白H3乙酰化的表达水平；RT-Q-PCR法测定H9C2细胞的心脏发育相关基因GATA4, TBX5, DHAND和EHAND表达量,以及ChIP-RT-Q-PCR法测定上述的心脏发育相关基因启动子区AcH3的水平。结果1)选用0μM、5μM、7.5μM及10μM SP600125处理H9C2细胞36小时后细胞生存率与对照组没有差异(P<0.05),15μm、20μM及25μM SP600125使细胞生存率降低21.2%、36.8%、50.2%(P>0.05)。2)A1c组H9C2细胞的HATs酶活性和乙酰化组蛋白H3水平明显高于各实验组(K0.05),Alc和SP组的HATs酶活性和乙酰化组蛋白H3水平与Blank组、SP组及DMSO组相比无显著差异(P>0.05),SP组的HATs酶活性与Blank组及DMSO组相比无显著差异(P>0.05)。3)Alc组H9C2细胞心脏发育相关基因GATA4, DHAND和EHAND的mRNA水平明显高于各实验组(P<0.05),Alc和SP组心脏发育相关基因GATA4, DHAND和EHAND的mRNA水平和Blank组、SP组及DMSO组相比无显著差异(P>0.05)。各组间TBX5的mRNA水平相比无显著差异(P>0.05)。4)Alc组H9C2细胞心脏发育相关基因GATA4, DHAND和EHAND启动子区的AcH3水平明显高于各实验组(P<0.05),Alc和SP组心脏发育相关基因GATA4, DHAND和EHAND启动子区的AcH3水平和Blank组、SP组及DMSO组相比无显著差异(P>0.05)。各组间TBX5启动子区的AcH3水平相比无显著差异(P>0.05)。结论1)SP600125干预H9C2心肌细胞最适剂量是15μM。2)JNK信号通路参与酒精对H9C2细胞的HATs酶活性和组蛋白H3乙酰化水平的调节作用。3).INK信号通路参与酒精对H9C2细胞心脏发育相关基因GATA4,DHAND和EHAND的mRNA水平调节作用。4)JNK信号通路参与酒精对H9C2细胞心脏发育相关特异基因GATA4, DHAND和EHAND启动子区AcH3表达水平的调节作用。