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目的:蜱传脑炎病毒(Tick-borne Encephalitis Virus,TBEV)、基孔肯雅病毒(Chikungunya Virus,CHIKV)、黄热病毒(Yellow Fever Virus,YFV)与埃博拉(Ebola Virus)病毒均是高致病性烈性病毒,对于这些病毒的实验研究需要在高等级的生物安全实验室中进行,增加了实验的成本和难度。为了能够降低实验感染风险,能在低等级生物安全实验室完成相关病毒的检测与鉴定,本实验根据4种高致病性病毒的分子结构特点,分别选取了适合用作诊断抗原的基因,用不同的表达系统表达抗原,为这4种高致病性烈性病毒的血清学特异性诊断提供了候选抗原。方法:1.将TBEV的pr M-E基因连接到p NLF1-sec N质粒中构建真核表达载体p NLF-pr M-E,并将重组质粒转染到COS7细胞中,与Nano Glo Luciferase荧光素酶蛋白进行融合表达,并通过测定细胞上清液的荧光素酶值鉴定蛋白的表达情况;间接免疫荧光试验鉴定重组蛋白与TBEV特异性抗体的结合情况;荧光素酶免疫共沉淀(Luciferase Immunoprecipitation System,LIPS)方法对20份TBEV病人阳性血清及3份正常人血清进行检测。2.通过原核表达的方法将CHIKV的E1、E2基因,YFV的E基因和Ebola V的NP基因重组表达,并通过镍柱亲和纯化重组蛋白;将CHIKV的重组蛋白作为检测抗原,通过ELISA方法对基孔恢复期病人感染血清中的特异性抗体进行检测;以YFV的重组蛋白作为检测抗原对实验室已制备的YFV免疫鼠血清中的特异性抗体进行检测;将Ebola V的重组蛋白NP作为免疫原免疫小鼠,并以NP蛋白作为检测抗原对免疫小鼠血清中的特异性抗体进行检测。结果:1.转染重组质粒p NLF-pr M-E的细胞上清中可检测到荧光素酶的高表达;间接免疫荧光试验检测到用p NLF-pr M-E重组质粒转染的细胞与TBEV抗体特异结合;LIPS方法以重组蛋白pr M-E为检测抗原从20份TBEV患者血清中检测出19份阳性结果,3份正常人血清均为阴性。2.成功表达并纯化出CHIKV的CHIKV E1-1、CHIKVE2-1与CHIKV E2-2重组蛋白,YFV的YFV E1-1、YFV E1-2与YFV E2-1重组蛋白,以及Ebalo V的NP重组蛋白;未能成功表达CHIKV E1-2与YFV E2-2重组蛋白;CHIKV E1-1、CHIKV E2-1与CHIKV E2-2三种重组抗原作均能与基孔恢复期病人感染血清特异性结合,并与同属病毒免疫的对照血清无交叉反应;YFV E1-1、YFV E1-2、YFV E2-1三种重组抗原均能与YF免疫鼠血清中的抗体良好结合,虽与DEN3型患者血清有一定的交叉反应,但与阳性鼠血清相比可以辨别区分;成功制备了Ebola V免疫小鼠血清,血清中的抗体能与重组抗原NP特异结合,并与其它对照血清无交叉反应。结论:1.成功构建了真核表达载体p NLF-pr M-E,并在COS7细胞中进行了表达pr M-E蛋白具有良好的抗原性,可作为TBEV感染的检测抗原。2成功构建了CHIKV E1-1、CHIKV E2-1、CHIKV E2-2、YFV E1-1、YFV E1-2、YF E2-2与NP的重组表达质粒,均能在原核细胞中正确诱导表达蛋白;CHIKV E1-1、CHIKV E2-1、CHIKV E2-2、YFV E1-1、YFV E1-2、YFV E2-2与NP重组抗原均有良好的抗原性,有望作为CHIKV、YFV和Ebola V检测的候选诊断抗原。