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目的转CrylAb/Ac水稻(TT51)是华中农业大学于近年将CrylAb/Ac导入亲本水稻明恢63(MingHui63)后培育获得的具有我国自主知识产权的一种新型转Bt基因水稻,其在前期田间试验中表现出优异的抗虫特性,并于2009年底获得农业部颁发的安全生产证书。由于近年来人们对转基因食品的食用安全性一直较为关注,因此本课题中开展了TT51对大鼠两代繁殖和神经发育影响的研究,并初步建立转基因作物生殖发育毒性的评价方案和技术方法,从而进一步丰富TT51的食用安全性资料,为转基因水稻的发展提供科学依据。方法1TT51大鼠两代繁殖试验研究1.1TT51中CrylAb/Ac蛋白定性定量检测及TT51和饲料成分分析采用Quickstix kit for CryAb/Corn Leaf&seed试剂盒以及ELISA半定量法测定对TT51、MingHui63和Control (Control)三种大米进行Cry1Ab/Ac蛋白定性定量测定。采用国标方法测定TT51、MingHui63和Control的蛋白质、碳水化合物、脂肪、纤维素、维生素、矿物质含量并进行重金属、农药和黄曲霉毒素B1等成分检测。1.2TT51大鼠两代繁殖试验研究4周龄F0代Wistar大鼠给以基础饲料喂养适应一周后,随机分为Control组、MingHui63组和TT51组,每组30只雌鼠15只雄鼠。各组动物给予将相应受试大米以60%比例掺入的饲料饲喂,喂养70d后各组雌雄大鼠于每晚18：00按雌雄比1：1合笼交配,次日清晨7：00做阴道涂片或者观察阴栓,以在光学显微镜下观察到精子或者发现阴栓当天记为孕0d,孕鼠单笼饲养。两周的交配期结束后处死FO代雄鼠,并进行相关检查。子鼠出生后第4天进行标准化,调整至8只／窝,雌雄各半。至F1代断乳应保证每组不少于20窝。在交配期、妊娠期,直至子代Fl断乳期间,F0代雌鼠持续给予受试物。F1代断乳后,给予相应受试物,重复上述过程并将一直延续到F2代70天。观察指标：观察各代大鼠的生长发育状况；记录大鼠生长发育期及雌鼠妊娠期和哺乳期体重、进食量并计算食物利用率；记录各代大鼠生殖相关指标(雌性大鼠动情周期、交配成功率、受孕率、妊娠时间、活产率、子鼠出生成活率、窝平均子鼠数、子鼠雌雄比率、子鼠出生平均体重、雄性大鼠精子数量和畸形率)；观察子代大鼠早期生理发育观察指标,子鼠出生后子鼠以窝为单位,检查全部Fl和F2代子鼠生理发育指标(耳廓分离时间、门齿萌出时间、睁眼时间、阴道开放时间、睾丸下降时间)检查。各组发育指标达标标准为同窝所有子鼠该项指标均达标的天数,每组观察20窝以上。试验末期,腹腔注射1%戊巴比妥钠(60mg/kg)麻醉取血分离血清检测成年大鼠血常规、血生化指标、雌雄大鼠性激素水平；组织器官取材,称重测定器官脏器系数,10%甲醛固定进行组织病理学检查,HE染色对亲代和子代大鼠进行组织病理学检查。1.3TT51暴露对子代大鼠生殖系统的影响1.3.1F1代雌性子鼠子宫增重试验于F1代大鼠断乳后,从各组(Control组、MingHui63组和TT51组)随机抽取8只,每窝至多1只雌鼠进入下一轮试验。按1mL/kg的容积经腹腔注射给与3μg/(kg·d)雌二醇(E2),连续3d,最后一次注射6h后,将子鼠脱颈椎处死,解剖分离子宫及卵巢,剔除子宫多余脂肪,称量子宫湿重和子宫干重,计算子宫的脏器系数。1.3.2TT51暴露对F1代雄性大鼠生殖系统的影响于F1代大鼠断乳后,从各组(Control组、MingHui63组和TT51组)随机抽取8只,每窝至多1只雄鼠进入下一轮试验。各组均给予普通饲料至70日龄,其间每周称量体重并记录食物消耗量和动物生长发育状况。腹腔注射1%戊巴比妥钠(60mg/kg)麻醉处死,进行血常规、血生化、血清性激素水平、生殖器官重量以及精子参数等指标检测。1.4TT51暴露对子代雄性大鼠下丘脑-垂体-睾丸轴相关mRNA相对表达的影响于Fl代交配完毕后,各组(Control组、MingHui63组和TT51组)随机挑选8只F1代雄性大鼠麻醉取血后,迅速分离睾丸、下丘脑和垂体；测定睾丸标志酶ACP、LD和SDH活性,实时荧光定量PCR法分析GnRH、FSH、LH和Ar mRNA相对表达情况。2TT51暴露对子代大鼠神经行为和学习记忆能力的影响2.1子代早期神经发育指标子鼠出生后子鼠以窝为单位,检查全部F1和F2代子鼠早期神经发育指标(平面翻正、悬崖回避、空中翻正、前肢悬挂)检查。各发育指标达标标准为：同窝所有子鼠该项指标均达标的天数。每组观察20窝以上。2.2F2代感觉运动组合测试于PND28从各组(Control组、MingHui63组和TT51组)随机挑选雌雄大鼠各10只动物,选择伤害性知觉测试、平衡能力测试、抓力测试、运动神经能力测试、自主活动能力测试作为感觉-运动行为测试组合对F2代雌雄大鼠进行测试。以上所有试验测试3次,每次间隔30min,结果取平均值。2.3F2代学习记忆组合测试分别从各组(Control组、MingHui63组和TT51组)随机选取的雌雄大鼠各10只进行学习-记忆相关的行为学检测,包括避暗箱试验、跳台试验、旷场试验和Morris水迷宫试验,通过上述实验检测大鼠的被动回避和主动回避能力、自主活动能力和空间学习记忆能力,观察TT51对子代大鼠学习记忆能力的影响。其中避暗箱试验、跳台试验于于PND35进行,旷场试验和Morris水迷宫试验于PND70开始进行。结果1TT51大鼠两代繁殖试验研究1.1TT51中Cry1Ab/Ac蛋白定性定量检测及TT51和饲料成分分析Cry1Ab/Ac蛋白定性测试结果显示,Cry1Ab/Ac蛋白仅在TT51中阳性表达,ELISA半定量检测方法测得,TT51中CrylAb/Ac蛋白含量为0.03187μg/g。营养成分分析检测结果表明,TT51、MingHui63和Control大米在主要营养成分上含量相近,均在文献报道的范围之内。在矿物质和维生素上,除个别元素如铜和磷外,大部分含量相近;三种大米主要营养成分含量差别不大,均在文献报道的正常范围之内。此外,测定了三种饲料在重金属、农药和黄曲霉毒素含量,以排除饲料成分对试验结果可能造成的干扰和影响。1.2TT51大鼠两代繁殖试验研究大鼠两代繁殖试验研究结果表明,与Control组和MingHui63组相比,TT51对大鼠生长发育及妊娠哺乳期的体重、进食量及食物利用率；繁殖指标(雌性大鼠动情周期、交配成功率、受孕率、妊娠时间和活产率、出生成活率、窝平均子鼠数、子鼠雌雄比率、出生窝总重、子鼠出生体重、雄性大鼠精子数量和畸形率1；Fl和F2代子鼠生理发育指标(耳廓分离时间、门齿萌出时间、睁眼时间、阴道开放时间、睾丸下降时间)的影响不具有统计学意义差异(p>0.05)；雌雄成年大鼠部分血液和生化指标存在显著差异,这些指标主要集中在TT51和Control之间,同时这些差异均在正常范围之内,所以不具有生物学意义。各组成年雌雄大鼠血清性激素水平未见显著性差异(p>0.05)。各组成年大鼠脏器系数组织病理学检查均未见异常改变,及病理切片,均未见病理学意义的异常。1.3TT51暴露对子代大鼠生殖系统的影响1.3.1F1代雌性子鼠子宫增重试验各组(Control组、MingHui63组和TT51组)各未处理组子宫湿重和子宫干重系数未见显著性差异(p>0.05);与未处理组相比,各组雌二醇处理组子宫湿重和子宫干重系数显著性增加(p<0.05),各组雌二醇处理组之间子宫湿重和子宫干重系数未见显著性差异(p>0.05)。与Contro组和MingHui63组相比,TT51暴露后未见对F1代雌性大鼠对雌二醇的敏感性的影响具有显著性差异(p>0.05)。1.3.2TT51暴露对F1代雄性大鼠生殖系统的影响Fl代雄性大鼠断乳后,各组(Control组、MingHui63组和TT51组)均给予普通饲料至70日龄,在此期间未见每周称量体重增长和食物消耗量变化有显著差异(p>0.05)和各组动物生长发育状况未见异常。未见各组动物血常规、血生化、血清性激素水平、生殖器官重量以及精子参数等指标检测有统计学意义上的显著差异(p>0.05)。1.4TT51对F1代雄性大鼠下丘脑-垂体-睾丸轴相关mRNA表达的影响测定结果显示未见各组(Control组、MingHui63组和TT51组)之间F1代雄性大鼠睾丸标志酶ACP、LD和SDH活性变化有显著性差异(p>0.05)；未见各组GnRH、FSH、LH和Ar mRNA相对表达水平有显著性差异(p>0.05)。2TT51暴露对子代大鼠神经行为和学习记忆能力的影响2.1子代早期神经发育指标子鼠出生后子鼠以窝为单位,检查了全部F1和F2代子鼠早期神经发育指标(平面翻正、悬崖回避、空中翻正、前肢悬挂),检查结果显示,未见各组(Control组、MingHui63组和TT51组)之间子鼠早期神经发育指标显著性差异(p>0.05)。2.2F2代感觉运动组合测试选择伤害性知觉测试、平衡能力测试、抓力测试、运动神经能力测试、自主活动能力测试作为感觉-运动行为测试组合于PND28对F2代雌雄大鼠进行了感觉-运动行为学测试,测试结果显示未见各组(Control组、MingHui63组和TT51组)雌雄大鼠上述指标有显著性差异(p>0.05)。2.3F2代学习记忆组合测试分别对各组(Control组、MingHui63组和TT51组)雌雄大鼠各12只进行学习记忆相关的行为学检测,包括避暗箱试验、跳台试验、旷场试验和Morris水迷宫试验,通过上述实验检测大鼠的主动回避能力和被动回避、自主活动能力和空间学习记忆能力,测试结果显示未见各组雌雄大鼠上述指标显著性差异(p>0.05)。结论1.大鼠给予受试物繁殖两代后,各组(Control组、MingHui63组和TT51组)大鼠及子代健康状态良好、行为正常,未出现死亡及中毒症状,也未发现动物畸形。与Control组、MingHui63组相比,未见TT51暴露对大鼠生殖和发育指标的影响具有显著性(p>0.05)。2.本研究首次通过对下丘脑-垂体-睾丸轴探讨了TT51暴露对F1代雄性大鼠生殖能力的影响,与Control组、MingHui63组相比,未见TT51暴露对F1代雄性大鼠睾丸标志酶活力和下丘脑-垂体-睾丸轴相关mRNA (GnRH、FSH、LH和Ar)相对表达水平的影响具有显著性差异(p>0.05)。3.本论文首次结合两代繁殖毒性实验设计,研究TT51暴露对子代大鼠神经发育的影响,与Control组、MingHui63组相比,未见TT51暴露对F1和F2代大鼠神经发育指标、F2代大鼠感觉-运动功能和学习-记忆能力的影响具有显著性差异(p>0.05)。