灵芝酸,一种三萜类化合物,是灵芝细胞中重要的生物活性成分。研究发现,灵芝酸具有抗肿瘤、抗HIV、抑制胆固醇的合成以及抗氧化等多种药理功能。而灵芝酸的低产量,成为限制其商业应用的重要因素。研究灵芝酸生物合成的调控机制,成为近年来的热点。前期的研究发现,外源添加钙离子能够明显的提高灵芝酸的含量,而钙调磷脂酶是钙信号中的一个重要调节蛋白。但是,我们并不清楚钙离子对灵芝酸生物合成的调控过程中,钙调磷脂酶是否参与,以及如何调控灵芝酸的生物合成,而这需要进一步的研究。在本研究中,首先克隆到了编码钙调磷脂酶催化亚基的两个基因,分别为cna1和cna2。其中,cna1基因的序列全长为2680 bp,编码序列为2007 bp。cna2基因的序列全长为2645bp,编码序列为1971 bp。同时,在加钙条件下,对两个基因的表达量进行分析。结果显示,cna1和cna2的表达量最高分别为对照组的1.6倍和2.5倍。以上结果表明,钙调磷脂酶可能参与了钙离子对灵芝酸生物合成的调控。为了进一步研究钙调磷脂酶的功能,我们通过抑制其功能,研究它对灵芝酸生物合成的影响。首先对cna1和cna2分别进行基因沉默,并对沉默菌株中的灵芝酸含量进行测定。研究结果发现,分别进行基因沉默,对灵芝酸的产量并没有影响。而这可能是因为这两个基因在灵芝中的功能是相同的。因此,我们通过添加抑制剂环孢霉素A（Cyclosporine,Cs A）来抑制钙调磷脂酶的功能。并在添加抑制剂的条件下,测定了总灵芝酸和四种单体灵芝酸Mk,T,S和Me的含量分别为3.33±0.12 mg/100 mg;175.886±2.56、236.163±3.82、165.239±5.75和106.733±2.23μg/100 mg细胞干重,分别为对照组的0.67,0.47,0.49,0.21和0.74倍。并且,在抑制钙调磷脂酶活性的条件下,中间代谢产物鯊烯和羊毛甾醇的含量分别降低了0.24和0.22倍。而与灵芝酸生物合成相关的基因Farnesyl diphosphate synthase（FPS）、Squalene synthase（SQS）和Lanosterol synthase（LS）的表达量分别是对照的0.16、0.3和0.46倍。研究结果表明,抑制钙调磷脂酶的活性明显降低了灵芝酸的含量。此外,通过抑制钙调磷脂酶的功能,研究了它对转录因子crz1（calcineurin-responsive zinc finger 1）的翻译后修饰作用和细胞定位的影响。首先,获得了过表达Crz1-flag的工程菌株。然后在抑制钙调磷脂酶功能的条件下,通过Western Blot分析了工程菌株中Crz1蛋白的迁移率。当钙调磷脂酶的功能受到抑制时,磷酸化的Crz1蛋白的比例明显增加了。此外,通过荧光显微镜观察过表达crz1-gfp的工程菌株中Crz1蛋白在细胞中的分布。研究发现,在添加钙离子进行培养时,会使Crz1蛋白聚集到细胞核中;而在添加抑制剂的条件下,会使Crz1蛋白的核定位受到抑制。以上研究结果表明,钙调磷脂酶可能通过调节Crz1的活性,对灵芝酸的生物合成进行调节。在本研究中,我们发现钙调磷脂酶参与了钙离子对灵芝酸生物合成的调控作用。它可以通过调节下游转录因子Crz1的功能,对灵芝酸生物合成相关基因的表达量进行调节,进而调节灵芝酸的生物合成。通过研究钙调磷脂酶对灵芝酸生物合成的调节作用,有助于更好的了解灵芝酸生物合成的调控机制。