泛素E3连接酶Nrdp1在缺血再灌注心肌损伤中的作用及分子病理机制

来源 :北京协和医学院 | 被引量 : 0次 | 上传用户:kensy
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研究背景和目的:心肌梗死是引起心力衰竭主要原因。心肌细胞凋亡是导致心肌梗死的重要机制之一,但是调节心肌细胞凋亡的分子机制仍不完全清楚。近些年,许多研究提示泛素-蛋白酶体系统,特别是泛素E3连接酶在细胞凋亡中起着关键的作用。神经调节素受体降解蛋白1(Nrdp1)是近期发现的一种泛素E3连接酶,可有效调节细胞凋亡和免疫炎症反应等病理生理过程,但是Nrdp1在调节心肌细胞凋亡和心脏功能中的作用仍未见报道。因此,本研究拟应用转基因动物模型和体外心肌细胞实验,探讨Nrdp1在心脏缺血再灌注(I/R)损伤及心脏功能中的作用及分子机理。实验方法:(1)心脏通过结扎左冠状动脉前降支并再通来复制I/R模型;(2)培养大鼠乳鼠原代心肌细胞,利用腺病毒过表达Nrdp1和显性负性突变的Nrdp1 (Dn-Nrdp1),在缺血缓冲液中37℃培养2小时,更换培养基继续培养24小时,采用原位末端标记(insitu nick end-labeling, TUNEL)染色法和逆转录PCR (RT-PCR)法分别检测心肌细胞凋亡情况和炎症因子的mRNA表达水平;(3)构建心脏特异性表达Nrdp1转基因小鼠并行PCR分析进行鉴定,利用心脏超声测定Nrdp1转基因小鼠的心脏功能。野生型小鼠和Nrdp1转基因小鼠经I/R处理后,比较存活率并行丁TC染色观察心脏梗死面积的大小;采用TUNEL法及Western blot法检测心肌细胞凋亡和凋亡相关蛋白的表达;利用日&E染色和免疫组织化学染色法观察心脏组织结构的变化和炎症细胞的浸润;最后采用Western blot方法检测体外心肌细胞及体内小鼠心脏中Nrdp1及其主要底物蛋白和信号通路蛋白,如ErbB3、BRUCE、TBK1、MyD88、AKT、STAT3和MAPKs (mitogen-activated protein kinase kinases)的表达水平,探讨Nrdp1在I/R损伤中的作用及分子机制。实验结果:(1)心脏I/R损伤后上调Nrdp1的表达;(2)大鼠原代心肌细胞过表达Nrdp1促进I/R损伤诱导的心肌细胞凋亡、升高Bax/Bcl-2比值和上调炎症因子如TNF-a和IL-6表达;相反,过表达Dn-Nrdp1抑制I/R损伤诱导的心肌细胞凋亡、降低Bax/Bc1-2比值和下调TNF-α和IL-6的表达;(3)在基础条件下,心脏特异性表达Nrdp1对小鼠的心功能无明显影响,仅有下降的趋势。但是,在心脏I/R损伤后,过表达Nrdp1使心脏梗死范围增大、小鼠存活率降低、上调Bax、cleaved caspase-3和PARP表达水平,而下调Bcl-2的表达和促进心肌细胞凋亡;(4)心脏I/R损伤后,过表达Nrdp1加重了心肌组织结构紊乱和炎症细胞如巨噬细胞浸润明显增多;(5)体内过表达Nrdp1明显降低了其底物蛋白如ErbB3及下游信号蛋白如AKT.STAT3和ERK的表达;(6)体外心肌细胞过表达Nrdp1抑制了其底物蛋白ErbB3及下游信号蛋白的表达:相反,过表达Dn-Nrdp1却促进了上述蛋白的表达。结论:心脏特异性表达Nrdp1通过抑制其靶蛋白ErbB3及下游信号分子的激活,从而加重了I/R诱导的心肌损伤。提示Nrdp1可作为心肌缺血/再灌注损伤的一种新的潜在治疗靶点。
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