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放射治疗是肿瘤患者非常重要的治疗手段之一,但同时又给肿瘤病人带来很多并发症,影响或者限制了治疗效果,其中,放射性肺纤维化就是常见的并发症之一。肺部及胸部、头颈部肿瘤患者经过放射线照射后,容易导致放射性肺损伤(Radiation Induced Lung Injury, RILI),早期表现为放射性肺炎(Radiation Pneumonitis,RP),继而转变为放射性肺纤维化(Radiation pulmonary fibrosis, RPF)。放射性肺纤维化严重影响到患者的生活质量和生存时间,到目前为止,西医尚没有非常有效的治疗手段和方法,而适当的中医治疗往往能减少放射性肺损伤的发生,也可以改善症状,提高患者的生活质量。1.目的肺成纤维细胞是放射性肺纤维化的效应细胞,基于前期的实验研究,本研究拟采用血清药理学的方法,通过观察养阴清肺方和激素对钴60射线照射后的人胚肺成纤维细胞的不同影响,证实养阴清肺方是否能抑制细胞增殖,促进细胞凋亡,改变细胞生长周期,减少细胞因子TGF-β1及α-肌动蛋白的表达。阐明养阴清肺方是否通过影响细胞生长、细胞因子的分泌及蛋白的表达来减轻肺纤维化的发展,探讨养阴清肺方对放射性肺纤维化的作用,从而证实本方临床治疗放射性肺纤维化的有效性,为药物的进一步开发应用提供实验依据,推动中医药在治疗放射性肺纤维化中的应用。2.方法本实验分为4组：中药组、激素组、中药加激素组、空白对照组,采用血清药理学方法,分别给4组Wistar大鼠灌胃,然后采集血清,分装、保存。采用钴60射线照射人胚肺成纤维细胞,然后用不同含药血清对照射后的肺成纤维细胞进行干预。先采用不同照射剂量(分别为0Gy、3Gy、5Gy、8Gy)钴60射线照射人胚肺成纤维细胞,然后用MTT法检测不同照射剂量对细胞增殖的影响,选用对细胞增殖作用最强的照射剂量作为以下实验的照射量。采用前一实验所得出的最佳照射剂量照射肺成纤维细胞,然后分别加入不同组别的含药血清培养,分别于24、48、72小时后检测每组细胞的增殖情况,评估不同药物对肺成纤维细胞的抑制率。采用最佳照射剂量照射后,加不同含药血清培养,采用流式细胞技术分析肺成纤维细胞的凋亡及周期情况,分析细胞生长周期受不同药物干预后的变化情况以及不同药物对细胞凋亡的影响。TGF-β1在肺纤维化的发生、发展过程中起着非常重要的作用,将细胞通过照射和含药血清培养后,采用ELISA试剂盒检测培养24、48、72小时后不同组细胞分泌的细胞因子TGF-β1的含量；分析不同药物对肺成纤维细胞自身分泌TGF-β1的影响。α-肌动蛋白是肌成纤维细胞的特异性表达,而肌成纤维细胞在肺纤维化的发生发展过程中也起着很重要的作用。将细胞经过上述实验中的方法处理后,高内涵筛选方法观察α-肌动蛋白的变化情况,以分析不同药物对α-肌动蛋白表达的影响。3.结果经不同剂量(OGy、3Gy、5Gy、8Gy)射线照射后的各组的OD值与阴性对照组相比均有显著性差异(P<0.05),各实验组之间也有差异(P<0.05),且随着照射剂量的增加,细胞的生存率越高,细胞的增殖越显著,故用8Gy作为以下实验的照射剂量。肺成纤维细胞经8Gy钴60照射后,分别换用空白组、中药组、激素组、中药加激素组四组不同含药血清培养,用MTT分析细胞增殖情况。空白组与药物各组(中药、激素、中药加激素组)之间均有差异(P<0.05),且中药组、激素组、中药加激素组之间分别都有差异(P<0.05)。流式细胞仪分析细胞凋亡,在24小时这一时相,各药物组(中药、激素、中药加激素组)与空白组均有差异(P<0.05),且中药组、激素组、中药加激素组之间也有差异(P<0.05),中药组的作用最突出。在48小时这一时相,中药、激素、中药加激素组与空白组均有差异(P<0.05),而中药、激素、中药加激素组之间没有差异(P>0.05),但这一时间点细胞的凋亡率均明显小于24小时的细胞凋亡率。在72小时这一时间点,中药、激素、中药加激素组各组与空白组均有差异(P<0.05);中药、激素、中药加激素组之间亦有差异(P<0.05)。采用流式细胞技术对各组细胞的周期进行分析,在24小时内,空白组的各周期分布较均匀,G0/G1所占比例略大；各药物组(中药、激素、中药加激素组)的细胞周期主要阻滞在G0/G1期和G2/M期；空白组与各药物组(中药、激素、中药加激素组)的S期有显著差异(P<0.05),且各药物组的S期明显低于空白血清组；空白组与各药物组的G2/M期也有显著差异(P<0.05),且各药物组的G2/M期明显高于空白血清组。48、72小时与24小时呈同一趋势。用ELISA试剂盒检测TGF-β1的表达,空白、中药、激素、中药加激素组各组与未照射的K组之间在各个时相均有显著差异(P<0.05)；在24小时时相,空白组与中药组无差异(P>0.05),其余各组之间均有差异(P<0.05);在48小时时相,空白组与激素组无差异(P>0.05),其余各组之间均有差异(P<0.05);在72小时时相,空白组与中药加激素组无差异(P>0.05),中药组与激素组之间无差异(P>0.05),其余各组之间均有差异(P<0.05)。采用高内涵药物筛选系统进行检测α-肌动蛋白(α-SMA)的表达情况,空白组与各药物组(中药、激素、中药加激素组)均有显著差异(P<0.05)；中药、激素两组分别与中药加激素组都有显著差异(P<0.05),而中药与激素组两者之间没有统计学差异(P>0.05)。4.结论肺成纤维细胞经射线照射后,增殖明显加快,且在0-8Gy的照射范围内,这一趋势与照射剂量成正相关,随着照射剂量的加大,细胞的增殖和存活率也增加。中药加激素抑制细胞增殖的能力最明显,激素对细胞的抑制能力强于中药。在48小时内,药物对细胞的抑制率呈上升趋势；在48小时达到高峰；之后呈下降趋势。各药物组均具有明显的促进照射后肺成纤维细胞凋亡的能力。在24小时时相,中药促进细胞凋亡的能力明显强于其它两组(激素组和中药加激素组),且这一时相各组药物促进细胞凋亡的能力最突出。各组药物可能均是通过阻滞GO/G1期和G2/M期,减少S期而改变细胞周期,从而减少细胞的增殖并促进细胞的凋亡。24小时内,中药组抑制细胞分泌TGF-β1的能力很微弱,激素联合中药组的作用较强。在48小时时相,中药抑制肺成纤维细胞分泌TGF-β1的作用最强。在72小时时相,激素联合中药组抑制其分泌TGF-β1的作用减弱,中药和激素均能抑制细胞分泌TGF-β。各药物组均能减少经钴60照射后的肺成纤维细胞表达α-肌动蛋白,中药联合激素组抑制α-肌动蛋白表达的作用最强,中药和激素二者没有差异。