细胞中的糖链对许多细胞功能如生长发育具有重要的作用,抑制和切除细胞表面的糖链都会造成细胞的生长行为的改变,甚至凋亡死亡,而细胞表面的糖链对细胞黏附和迁移功能更是重要,某些 N-型糖链直接参与细胞与细胞外基质的接触和黏附作用,这种细胞与细胞外基质的作用和黏附在肿瘤转移过程中具有重要的意义。但是糖链的结构非常复杂,合成的时候没有既定的模板可以依照,不象核酸和蛋白质具有很好的规律性,糖链结构在相同的细胞表面有时候表现出复杂性,这些多样性的糖链正好是为了迎合细胞的功能所需要,所以在不同的功能阶段的细胞可能有不同的糖链结构表达,同时不同的糖链结构也会影响细胞的生物学功能。例如 N-型糖链中 β1,6GlcNAc 分枝的含量多少直接影响肿瘤细胞对细胞外基质如纤连蛋白、层粘蛋白黏附的强弱,剔除合成这种结构的糖基转移酶之后小鼠,或含有这种糖基转移酶的转基因动物,以及 knock out 小鼠和transgenic mouse 杂交后均可以显著地影响肿瘤在小鼠体内的转移能力。糖链还可以分布于不同的分子上,可以分布在糖蛋白分子,也可以在糖脂分子上。糖链合成主要依赖于细胞内的糖基转移酶,这些糖基转移酶的表达高低和活性的高低直接决定了糖链的合成;当然这些糖基转移酶具有高度的底物特异性,需要细胞内提供特异的糖链底物才能合成,如果缺乏特异性底物也会不能有效地合成糖链;此外糖链的合成还受很多其它因素的影响,糖链合成还受本身结构的影响,如果糖链出现一些终末糖基的时候,糖链合成可以停止。糖链中的岩藻糖基、唾液酸基和糖链磺酰化都是一些终末结构的糖基,本文将就糖链岩藻糖基化结构与糖链磺酰化结构的功能展开研究。全文共分六个部分,摘要如下一、磺酰化脑苷脂在肝癌细胞的表达 本部分研究观察乳糖基脑苷脂磺酰化结构在不同转移潜能的肝癌细胞中的表达,研究与肝癌细胞的转移潜能的关系。通过特异性单克隆抗体,采用免疫荧光染色和细胞酶联免疫两种方法,首先观察了高、低转移潜能的肝癌细胞中磺酰化脑苷脂(SM3、SM4)的表达水平,发现高转移性肝癌细胞 MHCC97H 表达磺酰化脑苷脂的水平明显高于低转移性肝癌细胞 MHCC97L,提示高低转移性肝癌细胞存在着磺酰化脑苷脂表达的差异。利用 10μmol/L 维甲酸处理高转移性肝癌细胞,抑制肝癌细胞的转移潜能以后,磺酰化脑苷脂的表达水平显著下降 3<WP=5>复旦大学 博士论文(P<0.05),接近低转移性肝癌细胞水平,但是磺酰化脑苷脂的前体分子半乳糖基神经酰胺水平并不降低,提示乳糖基脑苷脂的磺酰化作用受到了抑制。通过抗磺酰化乳糖基脑苷脂(SM3)单克隆抗体和抗磺酰化脑苷脂单克隆抗体(包括SM3, SM4)结合的比较分析,肝癌细胞表达差异的主要是磺酰化乳糖基脑苷脂。二、磺酰化脑苷脂在肝癌细胞的表达 为了研究高表达磺酰化脑苷脂对肿瘤细胞恶性行为的影响,本部分通过基因转染的方法建立了高表达磺酰化脑苷脂的细胞体系。磺酰基转移酶具有高度特异性,有些细胞即使高表达磺酰基转移酶基因,也不一定会有高的磺酰化产物合成。本部分通过脑苷脂磺酰基转移酶(CST)基因表达框架,插入到哺乳细胞表达质粒pCXN2 的克隆位点,构建成脑苷脂磺酰基转移酶的表达质粒。通过脂质体转染技术把这个表达质粒转染到人肝癌细胞 Hep3B 和黑色素瘤细胞 B16/F1 中,通过标记基因的筛选,获得转染细胞的克隆。进一步通过 Northern blot 分析筛选了高表达脑苷脂磺酰基转移酶基因的细胞克隆,对照载体质粒转染的细胞均没有 CST基因的表达,说明转染的细胞能够表达该基因;但是高表达 CST 基因不一定意味着细胞克隆具有高的脑苷脂磺酰基转移酶活性或其产物糖链的合成,因此通过特异性磺酰化脑苷脂单克隆抗体的检测,与这些克隆细胞进行结合,分别进一步筛选到了两个克隆细胞,在肝癌细胞克隆 CST 6 和 8,在黑色素瘤细胞为克隆CST 1 和 3。除了抗体的结合以外,本部分还直接提取了转染的肝癌细胞中酸性糖脂,进行薄层层析免疫印迹分析,结果发现转染的肝癌细胞中表达有较高的磺酰化脑苷脂,通过与标准品的对照以及单克隆抗体的识别,这种高表达的磺酰化脑苷脂主要为磺酰化乳糖基脑苷脂。黑色素瘤细胞也类似。本部分的研究显示CST 基因可以在肝癌和黑色素瘤细胞中高表达,并能够合成磺酰化产物。三、高表达磺酰化脑苷脂对肝癌细胞转移的的影响 磺酰化脑苷脂是细胞中重要的酸性糖脂成分,对细胞的黏附具有重要的作用,但是不清楚磺酰化脑苷脂在肿瘤转移过程中起什么作用。本部分通过脑苷脂磺酰基转移酶(CST)基因的转染,使 Hep3B 肝癌细胞高表达磺酰化脑苷脂,再观察高表达磺酰化脑苷脂水平对肝癌细胞转移潜能的影响。通过细胞黏附试验发现CST 基因转染的肝癌细胞对玻连蛋白(vitronectin)的黏附显著增强,比未转染的或转染载体的肝癌细胞升高 3~4 倍,对层粘连蛋白的黏附也有轻度的加强。这些黏附作用通过竞争性抑制试验,发现半乳糖基神经酰胺可以部分抑制对玻连蛋白和层粘蛋白的黏附作用,半乳糖基神经酰胺是磺酰化脑苷脂分子的前体,没有磺酰基团,作为竞争性抑制剂。为了