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研究背景及目的意义:多发性硬化(multiple sclerosis,MS)是中枢神经系统慢性炎症性自身免疫疾病,以脑和脊髓的轴突破坏及髓鞘脱失为主要病理特点。MS患者临床表现的严重程度不一,重者可致身体残疾,极大程度地降低患者的生活质量。实验性自身免疫性脑脊髓炎(experimental autoimmune encephalomyelitis,EAE)是MS基础实验研究常用的动物模型。树突状细胞(dendritic cell,DC)作为专职的抗原提呈细胞,在MS的发病过程中起重要作用。耐受性树突状细胞(tolerogenic dendritic cell,t DC)是一种特殊类型的DC,通过诱导调节性T细胞(regulatory T cell,Treg)的形成和促进抑炎因子的分泌,对MS具有潜在的治疗价值。程序性死亡受体(programmed death 1,PD1)和程序性死亡配体1(programmed death ligand 1,PDL1)属于B7超家族,通过发挥负性调节的作用在MS的发病过程中起一定的治疗作用。调节性B细胞(regulatory B cell,Breg)是B细胞的一种,可通过分泌抑炎因子在MS的发病过程中起抑制疾病发展的作用。1,25(OH)2D3是一种免疫调节剂,能够有效诱导t DC(VD3-DC)的形成,并将所诱导VD3-DC回输给发病的EAE小鼠后可发挥一定的治疗作用。本实验课题拟在体外先诱导骨髓来源的单核细胞成为DC,后经过具有免疫调节作用的1,25(OH)2D3诱导形成VD3-DC,检测正常DC和VD3-DC表面PDL1的表达,后将正常DC和VD3-DC回输给已发病的EAE小鼠:(1)观察回输治疗后EAE小鼠临床症状的变化;(2)检测脾脏和淋巴结T细胞表面PD1的表达;(3)检测脾脏和淋巴结B细胞中Breg的比例;(4)采用HE和LFB染色观察小鼠脊髓内炎性细胞浸润以及脱髓鞘病变情况。进而探究Breg、PD1、PDL1通过1,25(OH)2D3诱导的VD3-DC在实验性自身免疫性脑脊髓炎中的治疗作用及机制。研究方法:(1)用MOG35-55加完全弗氏佐剂(complete freund’s adjuvant,CFA)的混合乳液,经背部皮下注入C57BL/6小鼠中,于免疫当天和2天后分别经腹腔注射百日咳毒素(pertussis toxin,PTX)建立EAE动物模型;(2)培养基内分别加入白介素-4(interleukin-4,IL-4)和粒细胞巨噬细胞刺激因子(granulocyte-macrophage colony-stimulating factor,GM-CSF)(各10ng/ml)来刺激小鼠股骨和胫骨骨髓来源的单个核细胞诱导DC。诱导DC的同时在其培养基内加入1,25(OH)2D3(10-8M)来诱导形成VD3-DC。然后分别向正常DC、VD3-DC中加入脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)刺激24h,促进其成熟,通过流式细胞术检测DC和VD3-DC表面PDL1的表达;(3)将EAE小鼠分为三组,在DC/VD3-DC诱导的第8天,用MOG抗原孵育4小时后,将MOG抗原洗尽,分别将PBS、DC和VD3-DC经尾静脉回输给EAE小鼠(EAE小鼠诱导第10、13、16天),观察各组小鼠临床症状变化;(4)在回输治疗发病高峰期,分离经过回输治疗后的EAE小鼠脾脏和淋巴结细胞,通过流式细胞术检测细胞表面PD1的表达及Breg的比例;(5)在回输治疗发病高峰期,分离小鼠脊髓,通过苏木精-伊红染色(hematoxylin-eosin staining,HE)和卢克斯快蓝染色(luxol fast blue,LFB),观察对比治疗前后EAE小鼠脊髓炎性细胞的浸润和髓鞘脱失情况。研究结果:(1)根据我们前期实验可知,通过相同的实验方法可以成功诱导出EAE小鼠动物模型和VD3-DC。本实验通过流式细胞术检测可知与正常DC相比,VD3-DC表面PDL1的表达增多,且差异具有统计学意义;(2)与PBS对照组相比,DC和VD3-DC回输给EAE小鼠,可有效减轻其临床症状,且VD3-DC的效果更显著;(3)与PBS对照组相比,VD3-DC组和DC组脾脏和淋巴结T细胞表面PD1的表达均增加,且有统计学意义;但VD3-DC组和正常DC组之间PD1的表达差异无统计学意义;(4)与PBS对照组相比,VD3-DC组脾脏B细胞表面Breg(CD19+CD5+CD1d+)的比例显著增加,而正常DC组脾脏B细胞中Breg的比例减少,差异无统计学意义;同时VD3-DC组和正常DC组淋巴结B细胞中Breg的比例均有所增加,但差异无统计学意义;(5)根据HE和LFB染色可知,与PBS对照组相比,DC和VD3-DC回输EAE小鼠后,可降低小鼠脊髓炎性细胞浸润和髓鞘脱失程度,且以VD3-DC作用更显著。结论:(1)VD3-DC细胞表面PDL1的表达增加;(2)VD3-DC回输EAE后可有效减轻其临床症状;(3)VD3-DC回输可增加EAE小鼠脾脏和淋巴结B细胞中Breg的比例以及脾脏和淋巴结T细胞表面PD1的表达;(4)VD3-DC回输EAE后可显著降低脊髓内炎性细胞浸润和髓鞘脱失程度。