Kv7/KCNQ是一类延迟整流的电压依赖型的钾离子通道,其中KCNQ2/3通道已成为治疗癫痫和神经性疼痛等与神经元异常兴奋相关疾病的新型药物靶点。化合物QO-83是本课题组从设计合成的大量化合物中,经高通量筛选并进行结构优化得到的新型KCNQ离子通道开放剂,拥有自主知识产权。该化合物与阳性对照药瑞替加滨(RTG)相比,在细胞水平和整体动物模型中均表现出更高的生物活性,且通道亚型选择性更好。作为创新药物临床前研究的重要组成部分,本研究对其在大鼠体内吸收、分布、代谢和排泄进行了系统性研究。第一部分化合物QO-83大鼠血浆动力学研究目的:建立并验证测定大鼠血浆中化合物QO-83含量的液质联用方法,并应用于血浆动力学研究。方法:1.基于HPLC-MS/MS技术,在血浆基质中进行化合物QO-83含量测定的质谱和色谱条件开发,并根据FDA相关指导原则进行全方法学验证。2.按1 mg/kg体重单剂量尾静脉注射给药,按5、10 mg/kg体重单剂量灌胃给药,在不同时间点眼眦取血,测定血药浓度,可获得药动学参数,计算绝对生物利用度。结果:1.方法学验证表明,在血浆基质中化合物QO-83的精密度、准确度、线性、基质效应、提取回收率、稳定性均符合要求。2.按1 mg/kg体重单剂量尾静脉给药和5、10 mg/kg体重单剂量灌胃给药后,药物在动物体内的Cmax分别为1196.3、49.217、147.67 ng/m L,AUC(0-t)分别为1099.9、217.02、680.13 ug/L*h,AUC(0-∞)分别为1115.8、222.24、727.46 ug/L*h,t1/2为2.478 h,绝对生物利用度为5.06±1.58%。结论:本实验所建立的测定大鼠血浆基质中化合物QO-83含量的液质联用方法,快速、准确、灵敏度高,可满足检测要求。化合物QO-83半衰期适中,口服吸收差,生物利用度较低,有待开发新剂型加以改善。第二部分化合物QO-83大鼠体内组织分布研究目的:建立并验证测定大鼠各组织匀浆基质中中化合物QO-83含量的液质联用方法,并应用于化合物QO-83组织分布研究。方法:1.基于HPLC-MS/MS技术,在各组织匀浆基质中进行化合物QO-83含量测定的质谱和色谱条件开发,并根据FDA相关指导原则在肝组织匀浆中进行全方法学验证;在其他组织匀浆中进行关键项部分验证。2.按10 mg/kg体重单剂量灌胃给药后,分别在15 min、1 h、8 h解剖,取心、肝、脾、肺、肾、脑、胃、脂肪、膀胱组织和血液,并测定化合物QO-83在各组织和血浆中的含量,考察药物在大鼠体内各组织的分布水平。结果:1.以肝组织为例,方法学验证表明化合物QO-83的精密度、准确度、线性、基质效应、提取回收率、稳定性均符合要求,其他各组织的关键验证项符合要求。2.灌胃给药15 min后,各组织脏器中即可检测到较高水平的药物浓度,浓度范围在54.93~1230.83 ng/g;1 h时各组织药物浓度均有增大(胃、肺组织除外),浓度范围在74.38~747.33 ng/g;8 h后各组织器官的药物浓度均较低,浓度范围在2.64~534.75 ng/g(胃组织除外)。脑组织中的药物含量均高于同一时刻血浆含量,说明药物易通过血脑屏障。结论:本实验所建立的测定大鼠各组织生物基质中化合物QO-83含量的液质联用方法,快速、准确、灵敏度高,可满足检测要求。化合物QO-83在动物体内分布迅速且广泛,易于透过血脑屏障,未见明显组织蓄积。第三部分化合物QO-83大鼠体内排泄动力学研究目的:建立并验证测定大鼠粪便、胆汁、尿液基质中中化合物QO-83含量的液质联用方法,并应用于化合物QO-83排泄研究。方法:1.基于HPLC-MS/MS技术,在粪便、胆汁、尿液基质中进行化合物QO-83含量测定的质谱和色谱条件开发,并根据FDA相关指导原则进行全方法学验证。2.按10 mg/kg体重单剂量灌胃给药,测定粪便、胆汁和尿液中原药的含量,考察原型药物在大鼠体内的排泄途径和过程。结果:1.方法学验证表明,在粪便、胆汁、尿液中化合物QO-83的精密度、准确度、线性、基质效应、提取回收率、稳定性均符合要求。2.化合物QO-83在动物粪便和胆汁中的累积排泄量为1.14 mg,相当于给药量的56.63%,提示有部分药物已被代谢或以其它途径排出体外。药物在粪便中的累积排泄率为56.56%。药物在胆汁中的累积排泄率为0.067%。尿液中未检测到原型药物。结论:本实验所建立的测定大鼠粪便、胆汁、尿液中化合物QO-83含量的液质联用方法,快速、准确、灵敏度高,可满足检测要求。半数药物以原型形式从粪便和胆汁排出,剩余半数药物推测以代谢物等形式排出。第四部分化合物QO-83大鼠体内代谢研究目的:基于液质联用技术,对化合物QO-83在大鼠胆汁、血浆、尿液、粪便中的代谢产物进行分析鉴定。方法:1.采用液液萃取法对胆汁、血浆、尿液、粪便样品进行浓缩和处理。2.建立HPLC-QTOF-MS法及HPLC-QTrap-MS法结合Lightsight软件,对给药后胆汁、血浆、尿液、粪便中的代谢物进行分析。3.数据采集完毕后,使用Metabolitepilot 1.5、Peakview 2.2、Chemdraw14.0等专业软件结合药物代谢及化学裂解规律进行分析鉴定。结果:根据生物体内药物的代谢转化的规律以及母体药物总结的裂解规律,初步推测出6个Ⅰ相和17个Ⅱ相代谢产物。主要的代谢反应类型包括羟基化、酮基化、葡萄糖醛酸化、磺酸化、甲基化、乙酰化、磷酸化、氨基酸结合(甘氨酸化、谷氨酰胺化、半胱氨酸化、牛磺酸化)。结论:采用的基于HPLC-QTOF-MS和HPLC-QTrap-MS相结合的代谢物鉴定技术策略专属性好、灵敏度高、效率高、结果可信,可方便快捷的用于代谢物的初步鉴定。本实验总共检测到化合物QO-83的23种代谢产物,初步揭示了代谢规律。