水稻（Oryza sativa）作为重要的粮食作物,提供了全世界超过一半人口的口粮,对我国所在的亚洲地区尤为重要。同时水稻作为一种经典的单子叶模式作物,为人类研究和探索生命科学做出了巨大的贡献。基因编辑技术对包括动物、植物、微生物等领域的基因工程的发展起到了关键性的推动作用。2012年由科学家发现的来源于古生菌免疫机制的CRISPR/Cas9系统可以使Cas9蛋白在g RNA的引导下在基因组DNA的特异位点处进行切割产生突变。相较于锌指、TALEN等技术,CRISPR/Cas9系统可以在较为基础的实验室使用,在多个物种中已构建较为成熟的转化体系。CRISPR/Cas9技术在水稻中已有较为成熟的转化体系,但在CRISPR/Cas9系统编辑的转化事件中,插入的T-DNA将会在发挥作用后留在基因组内稳定遗传,在T1及后代中持续翻译Cas9蛋白并在g RNA等引导作用下带来基因组持续编辑等不稳定的影响。为准确观察表型,往往需要在后代中分离出无CRISPR/Cas9元件残留的突变个体,但分离过程往往需要耗费较长的时间与精力。如何快速高效的筛选出水稻的无CRISPR/Cas9元件的植株对CRISPR/Cas9系统水稻的应用有较大的意义,现阶段此方面国内外研究还较少。在杂交水稻生产中常常会利用雄性不育性状产生雄性不育系,根据细胞质雄性不育（Cytoplasmic male sterility,CMS）机理我们从数据库中挑选出CMS1（ORF11）,CMS2（orf H79）两种细胞质雄性不育基因,以及一种表达解淀粉芽孢杆菌毒蛋白Banarse基因,应用本实验室和玉兵博士构建的pCXUN-Cas9载体进行表达,使雄配子体致死性状与转基因事件相连锁。同时利用水稻REG2启动子在早期胚胎中表达Banarse毒蛋白,使雌配子体致死性状与转基因事件连锁。我们同时使用雌雄一对自杀基因,在T0代水稻转基因植株中分别将含有T-DNA插入的花粉以及早期胚胎杀死,使T0代种子（T1代）不需额外人工操作,直接萌发,即得到CRISPR/Cas9-free的后代植株,节省大量人力物力。为了高效的得到无Cas9元件残留的植株,进行有效的快速筛选,我们使用两种组成型启动子Ca MV 35S及Actin promoter分别启动两种CMS基因,CMS1及CMS2,同时用雄配子体特异性启动子Y1（来源于Os Ugp2）,Y2（来源于Os GEX2）分别表达Barnase毒蛋白以及一系列CMS基因,尝试产生雄配子特异毒性筛选Cas9-free花粉。同时串联REG2启动子启动毒蛋白Barnarse,使早期胚胎自行凋亡。我们已经清楚的证明了Ca MV 35S-ORF79与水稻REG2-Barnase串联的情况下,装配在本室p CXUN-Cas9载体中可以使水稻T0代形成的成熟花粉中表达毒性,产生无育性花粉,并且与野生型相比转化事件T0代结实率下降,说明在早期胚胎中Barnase毒蛋白发挥毒性。在T1代的PCR检测中未检测到转基因,同时将CRISPR/Cas9靶定在参与独脚金内酯合成的DWARF3（D3）基因,与致死载体串联,测序发现T1代中基因突变效率与原始载体一致,并且没有转基因阳性植株,说明元件都发挥了作用。在水稻T0代形成成熟配子体时,载体内致死基因便发挥作用,使带有活性TDNA插入的花粉及早期胚胎凋亡,大幅降低了转基因事件在群体当中的比例,有利于直接筛选出无CRISPR/Cas9元件的T1代植株。与常规的三到四代的筛选代次时间相比,本载体往往一代就可以得到有用的突变体,节省了大量时间与人力物力。