金针菇(Flammulina filiformis)富含赖氨酸,而赖氨酸对儿童的身高和智力发育有良好的作用,因此金针菇被誉为“增智菇”。基于金针菇全基因组测序结果,筛选到金针菇赖氨酸生物合成途径中的关键基因,确定赖氨酸是通过α-氨基己二酸途径(α-Aminoadipate pathway,AAA途径)合成的。以金针菇AAA途径为基础,以途径中的关键基因为核心,研究其分子机理和调控机制有助于开发金针菇的食用、商用价值,为研发金针菇新产品、培育金针菇新品种奠定理论基础。酵母氨酸脱氢酶(Saccharopine dehydrogenase,SDH)作为途径中的最后一个酶在赖氨酸的合成过程中发挥着重要的作用,但在金针菇中研究甚少。本研究通过两个外源影响因子——温度和茉莉酸甲酯来诱导金针菇赖氨酸合成途径,探索其分子机理和调控机制,并确定在合成过程中发挥重要作用的目的基因,进一步验证目的基因的功能,有助于加深对金针菇赖氨酸生物合成途径的理解,这也是首次对金针菇赖氨酸合成途径进行低温胁迫和茉莉酸甲酯诱导。主要研究内容及结果如下:1.对金针菇单核体菌株Dan3菌丝进行低温刺激,探索冷处理对SDH基因表达和赖氨酸合成的调控机制。将金针菇Dan3液体菌丝在不同温度(10、15、20、25℃)下培养7-10天后收集菌丝进行荧光定量PCR检测和赖氨酸含量检测;将金针菇Dan3液体菌丝培养7-10天(25℃)后在15℃的环境温度下分别处理0、2、4、6、8、10、12 h,收集菌丝进行荧光定量PCR检测和赖氨酸含量检测。结果显示,不同温度处理后,HCS、HIDH基因在15、20℃时的表达量增加;AAT1基因在10、15、20℃时的表达量增加,在20℃时的表达量较高;AAT2、AAR、SDR基因在20℃时的表达量增加;SDH基因在15℃时的表达量增加。菌丝体经过15℃处理后,除去4 h处理以外,其SDH基因表达量均增加;赖氨酸含量均有增加。研究结果表明低温影响金针菇菌丝体赖氨酸合成途径相关基因的表达和赖氨酸合成,为探索赖氨酸的合成机制提供参考。2.对金针菇单核体菌株Dan3菌丝进行Me JA诱导,探索Me JA诱导对SDH基因表达和赖氨酸合成途径的调控机制。以无水乙醇为助溶剂配置Me JA母液,设置Me JA浓度梯度(0μM、5μM、10μM、50μM、100μM、150μM、200μM、250μM、300μM)诱导金针菇Dan3液体菌丝的生长,收集菌丝进行荧光定量PCR检测和赖氨酸含量检测。结果显示,经不同浓度Me JA诱导后,SDH基因表达量表现出不同程度的上调和下调,而赖氨酸含量均上调,推测可能是在赖氨酸生物合成过程中受到多个酶的协同作用,Me JA在影响SDH的同时可能对通路中其他酶也起作用,进而影响了赖氨酸最终的合成量。因此,需要研究Me JA对通路中其他酶编码基因的转录水平的变化,为全面了解Me JA对SDH的调控机制提供强有力的理论信息,从而完善对SDH在赖氨酸生物合成途径作用的了解。3.对金针菇SDH基因进行生物信息学分析,包括序列分析、同源性分析、启动子分析以及构建系统进化树。为验证SDH的过表达功能,构建了金针菇SDH过表达载体(命名为p YN6981-SDH),利用农杆菌介导的遗传转化手段将SDH基因整合到金针菇染色体中,验证其过表达功能。具体方法为:以金针菇单核体菌株Dan3菌丝为受体材料,首次选择两种米粒(小米和大黄米)作为菌丝的培养基质和侵染基质进行比较,在利用农杆菌菌株LBA4404转化过程中,设置共培养时间梯度(3、4、5、6天)作为优化条件,在含潮霉素和头孢噻肟钠的PDA平板中进行初次筛选和二次筛选,将拟转化子进行PCR检测、e GFP绿色荧光验证,并将验证成功的阳性转化子进行荧光定量PCR和赖氨酸含量检测。农杆菌介导金针菇菌丝的转化效率较高,在小米和大黄米中的平均转化效率分别为41.0%和30.1%,二者均在共培养第6天时达到最高转化效率,分别为57.5%和47.5%。同时SDH基因的表达量和赖氨酸含量均处于上调趋势,从而验证了SDH基因的过表达功能,进而说明SDH基因的变化会影响赖氨酸的合成,推测其为途径中的关键基因。本研究主要从农杆菌介导的遗传转化和环境因子的调控两方面验证SDH的功能,推测其为金针菇赖氨酸生物合成途径中的关键基因。本研究结果将为探索其他关键基因的调控机制提供思路,同时在分子水平上对金针菇赖氨酸生物合成途径及其关键基因有了进一步的了解,为选育高赖氨酸含量金针菇品种提供理论基础。