背景和目的:糖尿病肾病（diabetic nephropathy,DN）是一种常见的代谢类疾病,其和终末期肾功能衰竭（ESRF）存在密切的关系,目前关于DN病理和疗法的研究在不断增加,并取得了很多重要的成果。相关研究发现在一定因素刺激下,相关炎性因子表达量会提高,引发NF-κB活化,这会导致糖尿病肾病的病情加重,不过其作用机理和相关信号转导通路还不是很明确。大量研究表明,参与炎症反应的单核巨噬细胞首先需要激活JAK/STAT信号通路并启动自身下游信号通路,导致巨噬细胞被激活并引发相关的炎性反应,这会增加此类患者的肾脏损害,因而在进行治疗时可以将其看作为相应的靶点。近年来中药治疗DN受到人们的关注,芍药苷（Paeoniflorin,PF）是白芍总苷的活性成分,其具有一定的抗氧化和提高机体免疫力的作用。在这项研究中,PF被用于链脲佐菌素诱导的糖尿病模型和高糖刺激的RAW264.7小鼠巨噬细胞系,从整体,细胞等角度分析了JAK/STAT信号通路的变化情况,并深入分析了此信号通路在糖尿病肾病发生和发展过程中的作用,为这种疾病的防治起到参考作用。方法:第一部分:采用RAW264.7小鼠巨噬细胞系,用CCK-8法检测PF干预和高糖刺激对RAW264.7小鼠巨噬细胞活力的影响。趋化实验观察高糖刺激及PF干预,JAK2/STAT3基因沉默对RAW264.7巨噬细胞趋化功能的影响。用不同梯度浓度的高糖刺激细胞,不同梯度浓度的PF进行干预,观察不同浓度葡萄糖在不同时间点对RAW264.7小鼠巨噬细胞信号通路蛋白表达的影响,从而确定实验所需高糖、PF的适合浓度,及实验观察的具体时间点。根据上述结果将RAW264.7小鼠巨噬细胞分组::正常糖浓度（LG）组,高糖刺激（HG）组,高糖+芍药苷（HG+PF）组,JAK2基因沉默（JAK2 simRNA）组,JAK2基因沉默+高糖（JAK2 simRNA+HG）组,JAK2基因沉默+高糖+芍药苷（JAK2 simRNA+HG+PF）组,STAT3基因沉默（STAT3 siRNA）组,STAT3基因沉默+高糖（STAT3 siRNA+HG）组,STAT3基因沉默+高糖+芍药苷（STAT3 siRNA+HG+PF）组,在相关的刺激时间点采集细胞上清液。并利用酶联免疫法测定细胞上清液中促炎因子TNF-α,MCP-1,IL-1β的表达;实时定量PCR检测各组细胞中促炎细胞因子TNF-α,MCP-1,IL-1β及iNOS的mRNA的表达;Western blot检测各组总蛋白中RAW264.7 p-JAK2,p-STAT2,iNOS蛋白的表达。第二部分:健康雄性C57BL/6J同窝野生型小鼠腹腔注射链脲佐菌素（streptozotocin,STZ）,50mg/kg,共注射5天,注射结束七天后检测尾静脉血糖浓度,超过16.7mmol/L者确定为糖尿病模型。模型小鼠随机分为糖尿病模型组,PF给药（25,50,100mg/kg.d）组和对照组,每组12只。注射结束后第第12周末采集两组研究对象的血、尿样本,并对其血糖、体重、肾重相关的指标进行检测;同时还检测CD68、p-JAK2、p-STAT3的表达水平;通过蛋白质印迹法检测肾组织p-JAK2/JAK2,p-STAT3/STAT3蛋白的表达;通过实时PCR法对肿瘤坏死因子-α,MCP-1,IL-1β的mRNA表达水平进行检测。结果:第一部分:（1）对比结果表明,实验所需的PF浓度对高糖环境中RAW264.7巨噬细胞活性没有产生明显的影响（P>0.05）。（2）蛋白质印迹法检测结果提示在25mmol/L时p-JAK2表达升高最明显（P<0.01）;当糖浓度为25mmol/L时p-STAT3表达增加最明显（P<0.01）;p-JAK2在刺激15min达到高峰（P<0.01）;p-STAT3在刺激24h达到高峰（P<0.01）。因此实验选择25mmol/L糖浓度的葡萄糖溶液进行培养,总共刺激二十四小时。与LG组相比,p-JAK2、p-STAT3蛋白表达均升高（P<0.05）,与HG组相比,当PF的浓度为10^-6mmol/L时,可降低RAW264.7的p-JAK2、p-STAT3蛋白表达量,10^-5mmol/L的PF对p-STAT3蛋白表达抑制作用最强（P<0.01）。因此后续实验选择10^-5mmol/L的PF作为干预浓度。（3）趋化实验结果表明高糖刺激可使得MCP-1对巨噬细胞的趋化作用增加,影响了巨噬细胞的转移,也降低了高糖的刺激效果。（4）实时PCR检测发现,和LG组相比,HG组iNOS、TNF-α、IL-1β、MCP-1mRNA表达量都有一定幅度提高,差异很明显。与LG组比较,JAK2 siRNA、STAT3 siRNA组可使iNOS、TNF-α、IL-1β和MCP-1mRNA水平不同程度降低（P<0.01）。与HG组比较,JAK2 siRNA、STAT3 siRNA和PF干预可使iNOS、TNF-α、IL-1β和MCP-1mRNA水平不同程度降低（P<0.01）。与JAK2siRNA/STAT3siRNA组相比,PF组仍可进一步下调iNOS、TNF-α、IL-1β和MCP-1mRNA水平（P<0.01）。（5）酶联免疫法检测发现,HG组细胞培养基中TNF-α、IL-1β、MCP-1分泌量显著高于LG组的（P<0.01）,而JAK2siRNA、STAT3siRNA组相比LG组,可使细胞培养基中TNF-α、IL-1β、MCP-1分泌水平不同程度降低（P<0.05,P<0.01）。与HG组相比,JAK2 siRNA、STAT3 siRNA和PF干预可使细胞培养基中TNF-α、IL-1β、MCP-1分泌水平降低（P<0.01）。与JAK2 siRNA/STAT3 siRNA模型组相比,PF干预仍可进一步降低细胞培养基中TNF-α、IL-1β、MCP-1分泌水平（P<0.01）。（6）激光共聚焦显微镜观察HG组M1型巨噬细胞特异性标志物一氧化氮合酶荧光强度显著高于LG组的,而JAK2/STAT3基因沉默会显著的降低一氧化氮合酶荧光强度。JAK2/STAT3基因沉默和PF干预可使高糖刺激下iNOS荧光强度减弱,而PF干预可使JAK2/STAT3基因沉默后iNOS荧光强度进一步减弱。第二部分:（1）12周糖尿病模型组血糖、肾重/体重相关的指标明显的高于对照组的,存在统计学差异;PF干预小鼠体重、肾重和24h尿白蛋白排泄率的变化均显著低于糖尿病模型组（P<0.05,P<0.01）。（2）在第12周时,在光学显微镜下观察,结果发现糖尿病模型组的肾组织中肾小球体积增大、系膜细胞比例增加,基底膜形态也出现了变化。PF干预肾组织状态有一定改善。（3）免疫组化检测发现,与对照组相比,第12周糖尿病模型小鼠CD68表达水平明显增加;和PF干预对比,CD68的表达量显著的下降,差异存在统计意义（P<0.01）。模型组p-JAK2蛋白在肾小球和肾小管间质中的表达显著高于对照组（P<0.01）,然而模型组仅p-STAT3蛋白在肾小管间质中的表达显著高于对照组（P<0.01）;PF给药组显著抑制了肾小球和肾小管间质p-JAK2蛋白表达（P<0.05,P<0.01）,肾小管间质p-STAT3蛋白高表达也得到明显抑制（P<0.05,P<0.01）。（4）Western杂交条带光密度分析显示,与对照组相比,模型组小鼠p-JAK2/JAK2与p-STAT3/STAT3蛋白的表达较对照组增加（P<0.01）,PF 25、50和100 mg/（kg d）给药12周可使肾组织p-JAK2/JAK2与p-STAT3/STAT3蛋白表达显著下降（P<0.01）。（5）实时PCR检测结果发现,模型组小鼠的促炎症因子TNF-α,MCP-1,IL-1βmRNA表达水平显著高于对照组,结果存在统计差异（P<0.01）;PF干预与模型组相比,TNF-α,MCP-1,IL-1β及iNOS mRNA表达则明显抑制（P<0.01）。结论:1)高糖环境下,RAW264.7巨噬细胞,细胞内JAK2/STAT3和下游信号通路表达上调,这显著增加了促炎症因子的表达量。这些信号通路的激活会受到PF干预和JAK2/STAT3基因敲除的影响,巨噬细胞的表型变化,以及其对炎症因子的表达,也会受到影响。2)研究表明JAK2/STAT3在糖尿病下的肾组织中表达水平有一定提高,同时会出现巨噬细胞浸润,系膜细胞增殖相关的病变,据此可判断出这种疾病发生过程中,此信号通路也参与。3)STZ诱导的JAK2/STAT3激活以及糖尿病小鼠肾组织中促炎因子和iNOS的合成增加,PF干预和JAK2/STAT3敲除可以下调这些蛋白的表达,表明糖尿病肾病发生的机制与JAK2/STAT3信号通路的激活有关,PF可通过抑制JAK2/STAT3信号通路的激活,改善糖尿病的炎症状态,但具体作用途径及靶点有待进一步研究阐明。