研究背景糖尿病肾病(Diabetic nephropathy, DN)是终末期肾脏疾病(end stage renal disease, ESRD)的最常见原因之一。约30%-40%Ⅰ型糖尿病,15%Ⅱ型糖尿病最终将进展为ESRD。大量临床研究表明,未控制的高血糖是糖尿病肾病发生发展的关键因素,但其作用机制仍不清楚。有研究表明,活性氧簇(reactive oxygen species, ROS)在高血糖诱导的细胞损伤中起重要作用。高血糖造成肾脏ROS生成增加,ROS可活化信号转导级联效应(如PKC、MAPK、JAK/STAT等),又可作为胞内信号激活某些转录因子(如NFκB、内皮素-1等),导致TGF-p1等表达增加。上述信号分子进一步诱导ROS产生,不断放大高糖造成的细胞损伤,导致细胞外基质(extracellular matrix, ECM)合成增加、基底膜增厚、系膜扩张,最终导致进行性的肾小球硬化和肾小管萎缩,引起肾功能下降和衰竭。尽管高糖造成细胞ROS产生增加已得到公认,但ROS产生的具体机制至今仍未阐明。Src同源区2结构域蛋白C(SHC)家族成员ShcA基因编码3种蛋白,分子量分别为46,52和66kDa(p46、p52和p66)。p66Shc是哺乳动物生命周期相关的蛋白,也是近年来研究细胞氧化应激的主要蛋白之一,敲除p66Shc基因可以使小鼠的寿命延长30%。大量研究表明,p66Shc在衰老及其相关的疾病中起关键作用,其共同机制为p66Shc的缺失加强了机体对氧化应激的抵抗。研究表明,p66Shc主要定位于胞浆,小部分(10%-40%)与线粒体热休克蛋白70(mHSP70)及线粒体内、外膜转移酶(TIM/TOM)形成复合物,定位于线粒体膜间隙。在正常情况下,p66Shc是失活的,不影响线粒体的功能,线粒体内的p66Shc只有在某些信号的作用下(p53/H2O2/UV等)才能解聚形成有活性的单体。另外,这些信号又可活化PKCβ,使胞浆内的p66Shc磷酸化,磷酸化的p66Shc可被脯氨酰异构酶(prolyl isomerase 1, pin1)识别从而异构化,进而在蛋白磷酸酶2A (Protein Phosphatase 2A, PP2A)的作用下去磷酸化进入线粒体,在线粒体内氧化细胞色素C产生ROS,开放线粒体通透性转换孔(mitochondrial permeability transition pore, mPTP),增加膜通透性,使大量离子、溶质和水涌入线粒体,导致线粒体水肿及形态/功能改变(包括降低钙离子反应和线粒体3D结构的改变)；同时,促凋亡因子如细胞色素C(cytochrome C)通过开放的mPTP释放到胞浆,激活caspases,导致细胞凋亡。研究显示p66Shc与糖尿病产生的氧化应激及其造成的血管损伤密切相关。有学者发现Ⅱ型糖尿病病人外周血单核细胞p66Shc表达较正常人明显升高,其水平与血浆8-Isoprostane(一个氧化应激标记物)水平呈正相关。Menini等的体内实验也发现,在小鼠体内敲除p66Shc基因,可以减少STZ诱导的Ⅰ型糖尿病肾病肾组织产生的氧化应激,保护肾脏组织结构和功能,改善肾组织病理变化,降低蛋白尿,抑制NFκB的活性,降低AGE的形成。上述研究均提示p66Shc与糖尿病及糖尿病肾病进展密切相关。但具体的机制尚不清楚。基于以上分析,我们认为p66Shc可能与糖尿病肾病细胞凋亡及ROS产生有关,为此,本实验开展如下的研究。目的利用STZ诱导的糖尿病大鼠模型,观察肾组织中p66Shc的表达变化,并探讨p66Shc与肾组织氧化损伤的关系。方法本实验分糖尿病组(STZ组)和正常对照组(Con组),每组10只雄性SD大鼠,体重190-220克。采用一次性腹腔注射STZ60mg/kg的方法建立Sprague-Dawley (SD)大鼠糖尿病模型(对照组注射等量PBS)。实验前检查随机血糖>16.7mmol/L,入选为糖尿病组。第8周处死大鼠,取肾组织。采用HE、Masson染色观察肾脏病理改变；DHE染色检测组织活性氧簇(ROS)；免疫组化、Western blot方法检测肾脏p66Shc表达变化,并分析p66Shc表达与肾组织氧化损伤的关系。结果SD大鼠腹腔注射STZ后72小时,大鼠随机血糖>16.7mmol/L,4周后测尿蛋白在30mg/24h以上,表明DN模型制备成功。糖尿病组大鼠血糖升高,出现明显多饮、多食、多尿等症状,与对照组比较,体重明显减轻；同时,肾脏体积明显增大,肾重明显增加。与对照组比较,STZ组大鼠肾组织肾小球体积增大,部分小球可见细胞数目增多,肾小球系膜基质增多；近端小管上皮细胞刷状缘减少或消失,部分肾小管萎缩和脱落、肾小管上皮细胞空泡样变性。对照组大鼠肾组织仅部分细胞胞核内表达极微弱的DHE红色荧光,STZ组大鼠肾组织大量细胞胞核内可见明显的红色荧光,较对照组显著增强,提示糖尿病肾病肾组织ROS产生增加。免疫组化结果显示：p66Shc在对照组大鼠肾组织有少量表达；糖尿病组大鼠的肾组织特别是肾小管中p66Shc表达显著增强。Western blot结果显示：糖尿病组大鼠肾组织p66Shc蛋白的表达显著升高,与对照组比较有显著差异。结论糖尿病状态下,大鼠肾脏特别是肾小管p66Shc表达显著增加；p66Shc表达增加的同时伴随肾组织ROS的大量产生,提示p66Shc可能在糖尿病肾病ROS的产生过程中起重要作用。目的探讨高葡萄糖对肾小管上皮细胞p66Shc蛋白表达及其第36位丝氨酸磷酸化的影响。方法用不同浓度D-葡萄糖(5.5mmM,15mM,30mM,45mM)处理正常人近端肾小管上皮细胞株(D-甘露醇作为等渗对照组),在不同时间点提取细胞RNA和蛋白,采用realtime-PCR检测p66ShcmRNA的表达变化,Westem blot检测p66Shc蛋白、磷酸化p66ShcSer36蛋白的表达。结果HK-2细胞经不同浓度D-葡萄糖处理后,p66Shc蛋白表达逐渐增高,呈浓度依赖模式；其中45mM葡萄糖处理后,p66Shc蛋白表达最强；等渗对照组p66Shc表达与正常对照组比较无显著性差异。HK-2细胞经30mM葡萄糖处理后,p66Shc mRNA表达逐渐增高,呈时间依赖模式,p66Shc mRNA在24h表达最强；p66Shc蛋白表达的结果与mRNA的结果相一致,在48h表达最强。HK-2细胞经30mM葡萄糖处理后,15min磷酸化p66Shc Ser36的表达即明显增加,90min达最高峰,之后逐渐降低,但在180min仍高于0min组。结论人近端肾小管细胞株HK-2表达p66Shc；高葡萄糖呈时间和浓度依赖模式上调HK-2 p66Shc的表达；高葡萄糖促进p66Shc Ser36磷酸化。目的探讨衔接蛋白p66Shc对高糖诱导的肾小管上皮细胞氧化损伤及凋亡的影响及其作用机制。方法常规培养正常人近端肾小管上皮细胞株(HK-2),分别用质粒pcDNA3.1 his p66Shc和pcDNA3.1 his p66Shc S36A(第36位丝氨酸突变为丙氨酸)转染HK-2细胞,建立稳定表达的细胞株。随后将细胞分为4组：1)未转染HK-2+5.5mM葡萄糖(正常对照组)；2)未转染HK-2+30mM葡萄糖(高糖组)；3)转染p66Shc WT的HK-2+30mM葡萄糖(p66Shc组)；4)转染p66Shc S36A的HK-2+30mM葡萄糖(S36A组)。采用Annexin V和Hoechst33258染色检测细胞凋亡；MitoSox Red染色检测细胞线粒体ROS含量；TMRE染色检测线粒体膜电位；Westem blot检测procaspase9、线粒体cytochromec及线粒体p66Shc在HK-2细胞的表达；提取线粒体DNA, PCR检测线粒体DNA的损伤；LDH检测试剂盒检测细胞上清液LDH的水平；TBA法检测细胞上清液MDA的含量。结果1.p66Shc细胞株鉴定：转染p66Shc WT和p66Shc S36A质粒的HK-2细胞p66Shc的表达较未转染的HK-2细胞显著增高。2.在高葡萄糖作用下,p66Shc在线粒体内聚集；p66Shc过表达增加高糖导致的细胞凋亡和线粒体ROS的产生；加重高糖导致的细胞线粒体膜电位下降,进一步激活线粒体凋亡通路激活：促进线粒体cyto c的释放和caspase 9的活化；p66Shc过表达促进高糖导致的细胞氧化损伤和线粒体DNA损伤。转染突变质粒p66Shc S36A对高糖导致的细胞损伤和凋亡无明显促进作用。结论p66Shc过表达加重高糖诱导的HK-2氧化损伤和细胞凋亡；p66Shc通过线粒体参与高糖诱导的肾小管上皮细胞氧化损伤和凋亡,可能在糖尿病肾病早期肾小管萎缩和细胞凋亡过程中发挥重要作用。