志贺菌(Shigella spp.)是一种具有高度传染性的革兰氏阴性肠道病原菌,儿童和农民是易感人群。志贺菌的感染剂量极低,且存在着多重耐药性,致使志贺菌的预防及治疗存在着极大挑战,针对志贺菌疫苗的研制更是重中之重。志贺菌携带的Ⅲ型分泌系统是对抗宿主免疫系统的重要武器,而毒力因子Ics A(Vir G)是其在宿主细胞间有效扩散所必需的。有研究表明,Htr A可以促进Vir G在细菌表面的准确定位,扮演着毒力因子的角色。此外,志贺氏菌的传播方式为粪口途径,在抵达其定植部位大肠之前,首先需要耐受胃酸等极端环境。目前在多种病原菌中已报道,Htr A对于细菌在高温、偏酸或偏碱性等极端环境下的生长具有重要作用。因此,对于Htr A蛋白酶功能的研究可以帮助我们发现更多的毒力相关蛋白,以便更好的了解志贺菌的具体致病机理,从而为疫苗的研制提供理论基础依据。Htr A蛋白在多数病原菌中序列保守,具有分子伴侣和蛋白酶活性双重功能,存在于周间质,是周间质内蛋白的重要质量调控因子。目前关于Htr A蛋白的报道,大多是针对它的分子伴侣和蛋白酶活性进行研究。然而,在实验室前期关于Arg T蛋白的研究中我们发现,Htr A蛋白在双向电泳胶图上呈现分子量相同但等电点不同的两个蛋白点,且两个蛋白点之间会根据底物变化出现“此消彼长”的现象。于是我们推测,Htr A可能存在着某种翻译后修饰。目前,针对Htr A蛋白的研究中尚未有关于此现象的报道。我们将从蛋白酶活性和翻译后修饰两方面对Htr A蛋白进行具体研究。拟通过本研究,找出志贺菌中Htr A的潜在底物蛋白,鉴定出更多毒力相关蛋白,为更好的了解志贺菌的致病机理提供依据。此外,通过已经解析出的晶体结构结合实验分析,在全新领域对Htr A蛋白进行研究,找出潜在的修饰位点并确定修饰形式。在Htr A蛋白酶活性的研究中,我们首先构建htr A的上调表达菌株和下调表达菌株。然后利用比较蛋白质组学的方法对比不同表达菌株的蛋白表达谱,分析潜在的底物蛋白。其中,上调表达利用外源导入阿拉伯糖操纵子实现可控诱导;下调表达则选择CRISPRi技术进行沉默。由于志贺菌的基因组存在大量可移动元件,特别是毒力核心区的自发突变率很高,因此在成功构建htr A上调和下调表达菌株后,需要对毒力基因进行PCR验证,以确保毒力核心区和基因组的完整性,以及后续研究的科学性和准确性。测序和毒力PCR验证完全正确的菌株,再使用自制的Htr A蛋白多克隆抗体,通过Western Blot检测Htr A蛋白表达的变化,实验结果证实上述上调表达和下调表达菌株均构建成功。菌株构建成功后,我们选择双向电泳技术对蛋白进行分离,再通过比较蛋白质组学分析可能存在的底物蛋白,并利用MALDI-TOF/TOF进行蛋白点的鉴定。由于Htr A蛋白存在于周间质,因此要寻找其天然底物蛋白,最直接的方法是提取周间质蛋白进行分析。另外,Htr A蛋白也参与外膜蛋白的合成,需提取外膜蛋白进行辅助验证。最后再通过全菌蛋白表达谱的对比,可进一步证明实验结果。在周间质蛋白提取物的表达谱分析中,我们选择不同温度(30℃发挥分子伴侣活性和37℃发挥蛋白酶活性)条件下的htr A上调和下调表达菌株周间质蛋白进行对比研究。最终的质谱结果分析得出:Pho N1、Pho N2和Gln H蛋白为潜在底物蛋白。其中Pho N1和Pho N2拥有50%的序列一致,均为周间质中的一种非特异性酸性磷酸酶。两者在37℃条件下提取的周间质蛋白中,htr A上调表达时,均出现明显的表达量偏低现象。然而在30℃时提取的周间质蛋白中,我们发现不同菌株间Pho N1和Pho N2蛋白表达量均没有明显差异,说明上述两个蛋白的差异表达与Htr A的分子伴侣活性无关。因此,推测Pho N2和Pho N1是Htr A的底物蛋白。此外,我们还发现在37℃条件下,周间质谷氨酰胺结合蛋白Gln H的变化趋势与Htr A蛋白的变化趋势截然相反,而在30℃却无明显差异,因此怀疑Gln H蛋白也是Htr A蛋白的底物蛋白。在37℃条件下外膜蛋白提取物的蛋白表达谱分析中,我们发现在Htr A蛋白的表达量降低时,外膜蛋白Omp A的表达量也随之降低。这一现象也验证了Htr A蛋白参与Omp A的合成一说。此外,在37℃条件下全菌蛋白表达谱的分析中,我们发现Pho N2的变化趋势同它在37℃时周间质中的变化相似,进一步证实了Pho N2是Htr A的底物蛋白。由于Pho N1的等点点为6.9,而全菌蛋白使用的是p H 4-7和p H 6-11的胶条进行的双向电泳,因此在最终的两个p H梯度胶图中都不能够鉴定到Pho N1蛋白。在关于Htr A的结构异构体研究中,先选择酶活位点突变株进行双向电泳,得到胶图上的Htr A仍为两个蛋白点,因此首先排除了酶活位点存在修饰的可能性。接着,采用高精度液相质谱先对双向胶图上的两个蛋白点进行分析。经Typsin、GLu-C、Chymotrypsin三种酶分别对Htr A的两个蛋白点进行消化后得出:修饰位点可能落在57-63位氨基酸区间。该区段位于Htr A晶体结构中的柔性Q-linker区域内部,无明确的三维结构定位,所以我们只能利用丙氨酸扫描逐个分析可能存在修饰的位点。我们通过对57位C、58位Q、59位E、61位S四个氨基酸进行定点突变,得到301/C57A、301/Q58A、301/E59A、301/S61A点突变株。双向电泳结果显示,这些突变株的双向电泳图谱中,Htr A均为两个蛋白点。因此,我们可以基本排除C57、Q58、E59和S61位存在修饰的可能性。综上所述,本研究通过外源阿拉伯糖操纵子构建htr A上调菌株,CRISPRi技术构建下调表达菌株。之后,用比较蛋白质组学分析37℃和30℃不同温度条件下,不同菌株周间质蛋白的表达差异情况,再辅以外膜差异表达蛋白和全菌差异表达蛋白进行验证,最终得出可能的底物蛋白为周间质蛋白Pho N1、Pho N2和Gln H。同时验证了Htr A参与Omp A的合成。对于Htr A可能存在的翻译后修饰,我们通过本研究,基本排除了S210、C57、Q58、E59和S61几个潜在的修饰位点,目前还不能确定具体的修饰位点及形式。