研究背景肾癌是一个复杂的异质性疾病,肾透明细胞癌是最常见的分型,并且占肾实质性肿瘤大约75%。早期局部肾癌病人在手术切除病灶后预后较好,但是,近30%的病人在初诊时就发现了转移灶。与其它实质性肿瘤相比,肾癌病人往往对放疗和化疗耐受,免疫治疗对已发生转移的晚期患者有一定的疗效。肾癌在男性的发病率高于女性,其比例约为2：1,最常发病于50-70岁年龄段。虽然我国的发病率低于全球平均水平,但2012年我国新发型66466例,约为美国新诊断病例的两倍,此差异可能源于环境的暴露和遗传倾向。我国肾癌在男性的发病率居所有肿瘤发病率的第七位。随着检查手段的不断进步,其发病率以每年大约2%的速率增长。基于目前的检测手段,25-40%的肾癌为偶发肾癌,25～30%的病人在初诊时就发现了转移灶的存在,且部分患者发生了亚临床转移。手术切除是治愈早期诊断肾癌的主要手段。初诊时就已经发生了转移的患者其中位生存期不足一年。肾癌对放、化疗均不敏感,故对于已发生局部或远处转移肾癌的治疗手段有限。开始于上世纪90年的以中、高剂量IL-2为基础的细胞因子治疗客观反应率不足30%。在西方国家,靶向治疗是晚期肾癌主要的治疗手段。肾癌靶向治疗主要有两类治疗药物,一类是酪氨酸酶抑制剂(TKIs)靶向肿瘤血管和哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)抑制剂。索拉非尼是第一个获准用于治疗IV期肾癌并推荐为一线或二线治疗的TKIs。其它包括舒尼替尼、依维莫司及阿西替尼在内各类靶向药物均存在价格昂贵或国内人群临床实验结果资料尚不完备等问题。[1]长期以来,寻找对肾癌敏感的药物都是科研工作者及医务人员感兴趣的问题。石蒜碱(lycorine,分子量287.313)最早由日本人森岛库太1937年从传统中药石蒜的鳞中分离得到的一种苄基苯乙胺类生物碱。活性研究表明,石蒜碱及其衍生物具有抗炎、抗病毒、抗疟疾、抗寄生虫、抑制乙酰胆碱酯酶、保护心血管及抗肿瘤、及最近发现的抑制破骨细胞生成等多种生物学作用。近年来,国内外合成了很多石蒜碱衍生物,如盐酸石蒜碱(Lycorine hydrochloride)、氧化石蒜碱(Lycobetaine)、二氢石蒜碱(Dihydrolycorine)、伪石蒜碱(Pseudolycorine)及其它一些做过结构修饰尚未命名的化合物。并对石蒜碱在各种肿瘤的作用及机制做了较多研究。目前未见石蒜碱对肾癌细胞较系统的研究。目的探讨石蒜碱对肾癌细胞786-O及ACHN的作用,观察两株不同恶性程度的肾癌细胞株的生物学行为改变,探索其可能的作用机制；为肾癌的治疗寻找新的思路。方法1.石蒜碱对肾癌细胞株786-O和ACHN生物学行为的影响1.1流式细胞仪分析石蒜碱对786-O及ACHN细胞周期及凋亡的影响取对数生长期的细胞,制成单细胞悬液,调整细胞密度为3×105mL,接种细胞到6孔板内,放人37℃,5%CO2培养箱培养过夜,待其长至50%汇合度时取出6孔板,吸尽培养液,依次加人预先配制好的浓度分别为0、1、2、5、10、25μmol/L的石蒜碱溶液2mL于准备处理的细胞中,培养24h后,收集细胞及其上清液,送孙逸仙纪念医院流式细胞室检测,同时凋亡检测及细胞周期分析。1.2 MTS检测石蒜碱对786-O及ACHN细胞增殖的作用取对数生长期的细胞,调整细胞密度并接种到96孔板,使达到2×103个/孔。设空白组和石蒜碱处理组,每组5个复孔。放人37℃、5%的CO2培养箱培养,待贴壁后换液并对石蒜碱组加药处理。分别于加药后0h、24h、48h、72h、96h各时间点加入20ul MTS,37℃孵育1h后,用酶标仪测490nm处OD值。1.3划痕实验、Transwell实验检测石蒜碱对786-0及ACHN细胞迁移、侵袭能力的影响用记号笔在六孔板底做记号,培养细胞至汇合度达90%以上,用中枪头在长满细胞的六孔板中划痕,注意比照板底记号,并于划痕后换液(处理组加药)。分别在划痕后12h、24h、36h拍照,用Image-Pro Plus 6.0软件计算不同时间点划痕宽度。实验设三个复孔。取对数生长期细胞,设空白组和石蒜碱组(5μmol/L),无血清培养基培养12h后(石蒜碱组加0.5μmol/L预处理)胰酶消化制成单细胞悬液,调整细胞数为1.5x105/mL。将4℃过夜融化的基质胶稀释后加入Transwell小室,37℃温育30min,取200u1细胞悬液加入小室,并避免产生气泡(迁移实验则不加基质胶)。24孔板相应孔加入600u1含15%FBS的RPMI-1640,培养48h后终止。PBS洗小室两遍,棉签拭去残留基质胶。先将小室置4%多聚甲醛溶液固定15mmin,再放入0.1%结晶紫染色液染色20min,最后以PBS清洗小室内和底部残留染色液,晾干后于倒置显微镜下观察拍照,并采用人工计数法,取四个随机视野统计细胞数。1.4平板克隆形成检测石蒜碱对786-O及ACHN细胞集落形成能力的影响取对数生长期细胞,以200/孔的密度接种到六孔板中。待细胞贴壁后换液并按正常对照组、5μmol/L石蒜碱组加药处理,静置生长10天后终止培养。用PBS缓慢清洗2遍后加入4%多聚甲醛固定10min,加入0.1%结晶紫染色15mmin,吸去染色液,风干并拍照。人工计数法计数细胞数大于50个的集落。2.石蒜碱对肾癌细胞株786-O作用的机制2.1用DCF-DA检测石蒜碱处理后786-O细胞内ROS水平的变化2.1.1接种细胞：使用96孔板,每孔接种1.5万个细胞。孵育DCFH-DA:接种24小时后用PBS液洗两遍,并换上终浓度为25μMDCFH-DA的RAPI-1640,培养箱孵育30 min.2.1.2结束DCFH-DA孵育后,吸弃培养基,用PBS液小心洗两遍。2.1.3检测并拍照：Zeiss倒置显微镜检测荧光。488nm激发波长,525nm发射波长。2.2实时荧光定量PCR检测石蒜碱处理后经典凋亡通路及NF-κB通路基因转录水平的变化Primerbank(https://pga.mgh.harvard.edu/primerbank/)查找相关基因引物,并委托上海生工公司合成引物。总RNA提取。逆转录合成相关基因cDNA。实时荧光定量PCR.采用2-△△T法分析基因的相对表达量2.3 Western-blot分析相关通路蛋白的变化蛋白提取于4℃、x1000 rpm条件下离心5 min后收集各分组不同浓度石蒜碱处理的细胞,加入蛋白提取液200ul,1%Triton,150 mM NaCl,25 mM Tris-HC1(pH7.2), 0.5mM EDTA,0.5mM Na3VO及蛋白酶抑制剂鸡尾酒片震荡混匀,冰上放置30min,4℃、×12000rpm离心30min,取上清。蛋白浓度测定及分装用BCA蛋白定量法测定各分组蛋白含量,按计算结果加5×上样缓冲液和去离子水。95℃,5 min,放-80℃保存备用。配胶及电泳根据蛋白分子量不同,配制8-12%的胶。各泳道取各分组蛋白标本20-50ug,并加入2-4ul marker进行常规聚丙烯酰胺凝胶电泳,每次电泳各泳道上样量应一致。电转及抗体反应转膜,BSA封闭,然后依次进行一抗和二抗反应。P-actin作为内对照。一抗二抗反应完均应用TBST漂洗3次,每次5min。化学发光、拍照根据试剂盒说明书配制免疫化学发光显色液。上机曝光,拍照。并用QuantityONE软件进行灰度值分析。结果1.石蒜碱对肾癌细胞株786-O和ACHN细胞生物学行为的影响1.1石蒜碱对ACHN和786-O半数抑制浓度(IC50)分别为24.3μmol/L、 11.3μmol/L。1.2石蒜碱能将肾癌786-O细胞剂量依赖性阻滞于S期(p<0.05),能将ACHN细胞阻滞于G0/G1期(p<0.01)。1.3与正常对照组相比,5μmol/L石蒜碱即能诱导786-O及ACHN细胞凋亡(p<0.05；p<0.01)、抑制786-0及ACHN细胞增殖(p<0.01；p<0.01)。处理后786-O细胞迁移能力(p<0.01)、侵袭能力(p<0.01)显著下降、集落形成能力呈剂量依赖性降低(p<0.05)；ACHN细胞迁移能力(p<0.01)、侵袭能力(p<0.01)显著下降、集落形成能力亦呈剂量依赖性降低(p<0.05)。2.石蒜碱对肾癌细胞株786-O作用的机制研究2.1 5uM石蒜碱处理786-O细胞后24h,倒置荧光显微镜观察发现,正常对照组和实验组均可见到绿色荧光,不同的是,实验组细胞形态基本已变为贴壁不牢的圆球形,荧光明亮,而正常对照组,细胞仍为贴壁紧密的梭形,荧光较暗。2.2 5uM石蒜碱处理786-O细胞后,实时荧光定量PCR检测发现,CDK4、 CyclinD1、CyclinD2、JNK、ERK1/2、IKB-α、P90RSK、和等基因表达下降；P53、MSK、STAT3、p38、AKT、以及RELA表达升高。2.3在786-O细胞Western-blot结果显示5μmol/L的石蒜碱即能上调Bax、 p-AKT、p-Bad、p-p38、p-ERK表达,而下调CDK4、 CyclinD1、Bcl-2、survivin、 p-P65、IKBα的表达。而p21,JNK、p38、IKKα、p65、pIKB-α等蛋白水平则变化不大。结论1.石蒜碱对肾癌786-O、ACHN细胞均有生长抑制作用；对786-O的生长抑制作用更明显。2.石蒜碱对肾癌786-O、ACHN细胞均有凋亡诱导作用；对786-O的凋亡诱导作用更强。石蒜碱能抑制肾癌786-O、ACHN细胞迁移、侵袭；3.石蒜碱能抑制肾癌786-O、ACHN细胞集落形成能力；4.石蒜碱可能通过刺激细胞ROS集聚、凋亡途径及NF-κB信号通路发挥对786-O的抗肿瘤作用。总之,石蒜碱对肾癌细胞具有明显的抗肿瘤效应。比较而言,石蒜碱对786-O作用较对ACHN细胞更强,二者抗肿瘤的机制并不完全相同,这可能和细胞株本身的恶性程度不同有关。该药可为肾癌的化疗或其辅助治疗提供新思路。