研究背景和目的肠易激综合征(Irritable bowel syndrome，IBS)是一种常见的消化道功能性疾病，其病理生理机制始终未被完全阐明。应用以往提出的肠道运动异常机制、内脏感觉过敏机制、脑肠作用机制、免疫机制等均难以全面解释IBS的发病机制。近年来对于IBS发病机制的研究逐渐深入到分子水平，认为IBS的发生可能具有其分子异常的改变。根据目前的研究发现肠道具有“自己”的神经系统(Entericnervous system，ENS)、又有机体最大的免疫系统和内分泌系统，目前认为肠道的神经、免疫、内分泌等是一个网络调控的整体，近来有人提出IBS“可塑性”发病机制的概念，而网络调控即可能是“可塑性”调控的物质基础，IBS很可能是这个网络调控失常所引起，而胃肠激素、免疫细胞因子、细胞受体、离子通道、5-羟色胺(5-hydroxytryptamine，5-HT)等可能作为这个网络调控的中间介质或不同“环节”，在IBS的发病机制中发挥一定的作用，并且认为这些生物活性物质或受体可能是IBS发病的分子生物学基础。那么，在这个网络调控中什么分子是关键分子，如何进行分子调控将是很有兴趣的问题，可能是今后研究IBS发病机制的重要内容。为了验证这一新的概念，本研究针对几个难以解释的IBS临床常见现象以及尚不明确的IBS发生机制，检测此网络中的几个重要分子，以探讨其在IBS发生中的作用。材料和方法1．32例女性腹泻型IBS患者(diarrhea predominant IBS，d-IBS)和21例女性健康对照者参与本研究。首先于空腹状态下采集静脉血，应用高效液相色谱检测方法测定受试者去除血小板的血浆中5-HT／5-HIAA(5-hydroxyindole aceticacid)浓度；其次，测定受试者饮220ml 37℃温水及饮同样体积4℃冷水后30，60，90，120，150，180分钟的血浆5-HT／5-HIAA浓度。同时问卷调查所有受试者腹痛／腹部不适、腹胀、腹泻等症状的发生情况，并对其严重程度进行评分。2．根据罗马Ⅱ诊断标准选择50例腹泻型IBS患者作为研究组，健康志愿者20例作为对照组。按既往有无进冷食冷饮后症状出现或加重的病史，将腹泻型IBS患者分为有对冷刺激敏感史及无对冷刺激敏感史两组；所有受试者行胃镜检查，镜下钳取胃窦黏膜-70℃保存备用；应用5-HT单克隆抗体标记EC细胞，应用ANKTM1单克隆抗体标记冷敏感温度受体，免疫荧光组织化学方法检测EC细胞和ANKTM1在腹泻型IBS患者和健康对照者胃黏膜的表达及分布情况。应用荧光实时定量RT-PCR方法检测胃黏膜TRPM8、ANKTM1的mRNA表达；3．根据功能性胃肠病的罗马Ⅱ诊断标准，选取IBS患者37例，FD(functionaldyspepsia)患者28例，其均为山东大学齐鲁医院消化科门诊病人，同时征募健康志愿者20例加入本研究。采集空腹静脉血，用ELISA方法定量测定受试者血清中牛肉、鸡肉、鳕鱼、玉米、螃蟹、鸡蛋、蘑菇、牛奶、猪肉、大米、虾、大豆、西红柿和小麦等14种食物抗原特异性IgG抗体水平以及血清总IgE水平，定性测定受试者血清中上述食物抗原特异性IgE抗体水平。另外，对所有入选患者进行了问卷调查及症状评分。评价IBS和FD患者症状轻重与升高的食物抗原特异性IgG抗体水平之间的相关性。4．应用免疫荧光组织化学检测奶脂球表皮生长因子8(milk fat globule-EGFfactor 8，MFG-E8)在肠黏膜巨噬细胞的表达；其次，应用一个经典的体外肠上皮细胞(IEC-18)损伤与修复模型，探讨MFG-E8对IEC-18细胞移行及损伤修复的影响及其作用机制；利用肠黏膜炎症损伤的动物模型进行在体实验，探讨MFG-E8蛋白在肠黏膜表达水平的改变及其对肠上皮细胞增殖、移行以及损伤修复的影响；分别应用重组MFG-E8蛋白以及MFG-E8单克隆抗体干预实验小鼠，观察肠上皮细胞的增殖、移行以及损伤修复的改变。结果1．空腹状态下，腹泻型IBS患者和健康对照者的血浆5-HT／5-HIAA无显著性差异；饮冰水后30，60，90，120，150分钟IBS患者血浆5-HT／5-HIAA浓度显著升高，5-HT代谢率(5-HIAA：5-HT)无明显变化，5-HT及5-HIAA峰值以及曲线下面积亦明显升高。饮温水未能引起上述结果。另外，饮冰水后19例IBS患者出现腹痛／腹部不适、腹胀、排便急迫感和／或腹泻等症状，有症状的IBS患者的血浆5-HT浓度较未发生症状的患者明显升高，且其5-HT浓度与症状轻重呈正相关。2．研究发现，d-IBS患者胃黏膜5-HT阳性细胞数目以及ANKTM1表达较健康对照组明显升高，既往有冷食、冷饮不耐受病史(冷食+)的d-IBS患者胃黏膜5-HT阳性细胞数目以及ANKTM1表达较无此病史IBS患者(冷食-)明显增多；在腹泻型IBS患者和对照者胃黏膜标本中均检测到了冷敏感温度受体TRPM8、ANKTM1的mRNA表达，荧光实时定量RT-PCR检测发现其表达在不同个体存在差异；对冷食、冷饮敏感的IBS患者胃黏膜冷敏感温度受体ANKTM1表达较无冷食、冷饮敏感史的IBS患者以及健康对照者明显增高；冷敏感温度受体TRPM8基因表达有增高趋势，但无统计学意义。3．与健康对照组相比，IBS患者血清中螃蟹(p=0.000)、鸡蛋(p=0.000)、虾(p=0.000)、大豆(p=0.017)和小麦(p=0.004)抗原特异性IgG明显升高，FD患者的血清鸡蛋(p=0.000)和大豆(p=0.017)抗原特异性IgG显著升高。与FD患者相比，IBS患者血清中螃蟹、鸡蛋、虾和小麦抗原特异性IgG显著升高。食物抗原特异性IgE阳性率在IBS、FD和对照组之间无显著差异(p=0.971)，血清总IgE抗体滴度在三组受试者之间亦无显著差异(p=0.978)。最后，症状评分与血清食物抗原特异性IgG水平的相关性研究表明，IBS和FD患者症状轻重与血清食物抗原特异性IgG水平未见显著相关性。4．免疫荧光染色显示MFG-E8存在于小肠上皮黏膜固有层巨噬细胞胞浆中。在体外IEC-18细胞损伤修复模型中，MFG-E8干预显著促进细胞移行与修复，并呈剂量依赖性。PKC抑制剂可阻断上述作用，提示MFG-E8经由PKC信号通路发挥作用。MFG-E8促进细胞移行及修复的机制在于其可结合于损伤边缘移行细胞膜暴露的磷脂酰丝氨酸结构，改变细胞骨架结构及形态，使之利于向前移动、爬行。在体实验表明，在肠黏膜炎症损伤的实验动物模型中，MFG-E8蛋白表达下降，同时肠上皮细胞向肠绒毛顶端移行速度减慢。给与实验动物重组MFG-E8蛋白可促进肠上皮细胞移行及修复。而MFG-E8单克隆抗体腹腔注射以及MFG-E8基因敲除可明显减缓新生肠上皮细胞向绒毛顶部的移行，因而影响上皮细胞的更新与修复。结论1．女性腹泻型IBS患者进食冷食、冷饮后的症状加剧与血浆5-HT水平升高有关。2．胃黏膜冷敏感温度受体TRPM8、ANKTM1表达高低和胃黏膜EC细胞数目的多少可能导致IBS患者与健康对照者对冷食、冷饮刺激的敏感性的不同。摄入冷食、冷饮对胃黏膜造成的冷刺激可能通过激活胃黏膜的冷敏感温度受体ANKTM1和／或TRPM8，直接或间接导致EC细胞活化释放神经递质，从而改变肠道的感觉、运动及分泌并引起症状的发生及加重。3．本研究中IBS与FD患者显著升高的血清食物抗原特异性IgG水平提示，食物引起的过敏反应与IgG而非IgE升高有关，这种IgG介导的胃肠道对某些食物的过敏反应可能为某些功能性胃肠病潜在的发病机制之一。因此，饮食中避免特殊过敏食物、研发低抗原性食物以及免疫调节治疗可能会成为上述功能性胃肠病的未来治疗手段之一。4．研究提示，MFG-E8是肠上皮巨噬细胞分泌的一种与肠黏膜损伤修复紧密相关的蛋白质。MFG-E8水平降低可能为某些胃肠黏膜炎性损伤疾病潜在的发病机制之一，而且本研究中重组MFG-E8蛋白所显示的促进肠黏膜损伤修复的作用，为上述疾病提供了新的治疗策略。意义本研究从肠道的神经-免疫-内分泌网络切入，探讨此网络调控中关键分子如胃肠激素、免疫细胞因子、细胞受体、离子通道、5-HT等与IBS发病的关系，寻找IBS发病的物质基础，从分子水平研究IBS神经-免疫-内分泌网络调控失常的中间介质或不同“环节”，为更深入地研究人类IBS的发病机制和防治策略提供了理论基础。