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生姜在我国栽培历史悠久,是重要的调味品和重要的中药。本实验以优质莱芜大姜为原料,研究了生姜蛋白酶的提取、纯化及活性检测技术,另外,以38种生姜为原料,测定不同品种生姜的蛋白酶、姜黄素、姜辣素的含量。(1)生姜蛋白酶活性测定方法最佳酶促反应温度为40℃,反应时间为5min,以酪氨酸为标准对照品计算酶活力值。通过比较紫外分光光度法(Abs 280nm法)和Lowery法两种酶活测定方法,证明紫外分光光度法(Abs 280nm法)具有操作简便、稳定性高、灵敏度好等优点,以此方法测得生姜蛋白酶在最适反应条件时的米氏常数为46.18μg/mL。(2)生姜蛋白酶提取方法通过正交试验及方差分析,姜汁浸提法方案为:缓冲液pH 7.5、离子强度0.03mol/L、料液比1:2、无水乙醇用量1:2.5,按此方案进行生姜蛋白酶的提取,得到的粗酶活力值843.7U,粗酶得率为1.40%。乙醇粉法提取生姜蛋白酶最佳提取工艺条件为:缓冲液pH6.5、离子强度0.10mol/L、打浆用无水乙醇料液比1:3。按此方案进行生姜蛋白酶的提取,测得酶活力值601.5U,粗酶得率为1.39%。(3)柱层析法纯化生姜蛋白酶使用Sephadex G-50 Medium为填料纯化生姜蛋白酶时,最佳层析柱为16×500mm,洗脱条件是:柱床体积(CBV)为100mL,洗脱速度1.5mL/min,洗脱缓冲液为磷酸缓冲液(pH 7.5 0.03mol/L),上样量为3mL(蛋白质含量42.7μg/mL)时。以此洗脱条件进行尺寸排阻层析(SEC)纯化,可以得到两个明显的洗脱峰,其中峰Ⅰ有酶活性。以姜汁酶活力为基准,粗酶的比活力为其1.98倍,而经过SEC纯化后,以比活力为考察指标纯化倍数达到4.19倍,是粗酶的2.11倍。使用Cellulose DE-52(洗脱速度0.5mL/min)与Sepharose DE-52 (Fast Flow)(洗脱速度1.0mL/min)两种填料进行离子交换层析(IEC)纯化,采用阶段洗脱法(总用量50mL,初始缓冲液与极限缓冲液变化梯度为5mL,共10个梯度)均可以得到6个较明显的蛋白峰,其中,以CelluloseDE-52为填料时,峰Ⅲ和峰Ⅳ有酶活;而用Sepharose DE-52 Fast Flow为填料时,峰Ⅱ和峰Ⅲ有酶活。离子交换层析结果与生姜蛋白酶的等电点有关,即生姜蛋白粗酶经过IEC纯化后,得到了两个等电点不同的组分,且都是酸性蛋白质。(4)生姜蛋白酶活力保护在缓冲液中添加半胱氨酸能有效地保护生姜蛋白酶活力,在室温(25℃)时,以0.015mol/L的半胱氨酸保持酶活力效果最好,保存180min的酶样品活力值为保存15min时的85%。在低温(4℃)时,0.020mol/L的半胱氨酸酶活力保持效果最好,保存第8天时活力值为第1天时的87%。(5) 38种生姜资源调查不同品种生姜的蛋白酶、姜黄素、姜辣素的含量均有较大的差异,以生姜蛋白酶比活力为考察目标,辽宁丹东姜、江西黄老门姜、山东莱芜大姜等均适合于提取生姜蛋白酶。