放线菌Z331-A的鉴定、培养条件优化及发酵液活性研究

来源 :海南大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:johnchen1001
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放线菌是生产多种活性次生代谢产物的重要产生者,是天然产物的重要来源,随着耐药现象的增加,从各种环境中找到有活性的放线菌,对其进行分离、鉴定,以及活性的研究,挖掘出有成药潜力的替代品显得尤其重要。本研究以分离自近海盐碱土壤中的一株放线菌菌株Z331-A为对象进行研究,对其形态特征、培养特征、生理生化特征进行观察,以及分子生物学方面进行鉴定。研究其分类地位,并对其发酵液抑菌活性和促进植物生长的活性进行研究。并用响应面对液体发酵培养条件进行了优化,得出了以下研究结果:1.通过16SrDNA序列的测定及其系统发育分析的研究,表明菌株Z331-A与Streptomyces rochei NBRC 12908的亲缘关系最近,在系统发育树上处于同一分支,相似性为99%。与原有的娄彻氏链霉菌模式菌株相比,Z331-A的培养性状、形态特征,以及生理生化特征与之相似,因此归入娄彻氏链霉菌,序列己在NCBI网站上注册,登录序列号为MF383408.1。2.通过含毒介质法测定Z331-A发酵液对7种植物病原真菌抑菌活性,结果显示,发酵上清液对供试的7种植物病原菌均有抑菌效果,抑制率达20.00%至69.10%。其中,对黄瓜炭疽病(Colletotrichum lagenarium)、烟草疫霉病(Phylophthora nicotianae)、芒果畸形病菌(Fusarium mangiferae)的抑菌能力较强,分别为69.10%、63.89%、62.50%。用纸片扩散法测定了 Z331-A发酵液对7种细菌的抑菌活性,结果显示Z331-A对供试菌株枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis ATCC6633)、副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)、大肠杆菌(Escherichia coil ATCC225922)、变形杆菌(Bacillus proteus CMCC49027)、金黄色葡萄球菌(Staphylococacus aureus ATCC6538)、MASA ATCC43300、MASA ATCC35951的抑菌圈直径分别为 20.01mm,13.02mm,16.03mm,8.10mm,15.10mm,14.00mm,12.20mm。3.从6种培养基中筛选获得ISP-2培养基所发酵的Z331-A发酵液对细菌抑菌效果最佳。以ISP-2培养基为基础,采用响应面法优化菌株Z331-A发酵培养条件,结果获得最优发酵条件为:发酵时间7.20 d,接种量5.70%,培养转速210r/min,装液量30mL·100mL-1,培养温度28℃。该培养条件所获得的菌株Z331-A发酵液对枯草芽孢杆菌的活性比优化前提高了26.56%,发酵液对MRSAATCC 43300菌株的活性也提高了 25.00%。4.以菌株MASAATCC43300为指示菌,测定Z331-A在最优发酵培养条件下的发酵液稳定性。研究发酵液经不同时间紫外线照射、不同酸碱度、不同温度条件下处理的抑菌圈直径大小的变化。抑菌实验结果表明,与对照相比,发酵液在紫外线处理1h内抑菌活性无显著性差异,在紫外线处理6 h后,抑菌圈仍有16.6 mm,为对照的97.65%,说明Z331-A对紫外线照射有很好的耐受性。发酵液在pH为5~8条件下处理1h,活性无显著性差异。当发酵液在pH 2的强酸性和pH10的强碱性条件下处理时,其抑菌圈直径分别为16.80 mm和16.10 mm,分别为对照的98.82%、94.70%。表明该发酵液不但在中性、弱酸及弱碱性条件下活性无损失,而且耐酸碱性也很好,且耐酸性强于耐碱性。当处理温度从50℃~70℃,发酵液活性无损失,没有显著性差异。当处理温度为80℃、90℃、100℃时,活性分别为对照的97.6%、81.88%、48.59%。仅当温度达到120 ℃时活性才为零。这表明该菌发酵液活性物质对温度耐受性较好。5.测定了 4个不同浓度Z331-A发酵上清液处理对番茄生长的影响。结果表明,Z331-A 发酵上清液 100 倍稀释液(106cfu/mL)、500 倍稀释液(2× 105cfu/mL)、1 000倍稀释液(105cfu/mL)均能显著促进番茄种子萌发、胚轴和胚根的生长,并促进番茄幼苗的株高、根长、鲜重、干重的增加。其中100倍稀释液处理的促生作用最为明显,其种子的简明活力指数最高;与仅用蒸馏水(CK)处理相比,促使番茄幼苗株高、根长、鲜重、干重分别增长了 115.29%、113.33%、115.52%、110.26%。发酵原液(108cfu/mL)对番茄种子萌发、幼胚生长及番茄幼苗的株高、根长、鲜重、干重的增加都有抑制作用,但对番茄幼苗的叶绿a含量、叶绿b含量、叶绿素总量有促进作用。
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