论文部分内容阅读
目的:构建SigE过表达耻垢分枝杆菌,通过应激功能试验,证实SigE表达成功有活性。观察SigE过表达耻垢分枝杆菌对多种药物生存率的变化,及敲除SigE或表达“抗SigE”对药物生存率的变化,反映SigE对药物敏感性影响。利用Rpf E促进持留菌复苏,检测复苏指数,了解SigE促进细菌持留影响药物敏感性的可能机制。经高通量测序分析差异基因,进一步了解SigE可能与细菌的哪些基因有关,为后续改善分枝杆菌耐药性的研究奠定基础。方法:1.PCR扩增出耻垢分枝杆菌sigE基因,克隆入质粒p MV261的多克隆位点,构建重组p MV261-SigE质粒,测序验证。重组质粒电转入耻垢分枝杆菌,Western blot检测SigE的表达。2.通过十二烷基硫酸钠、酸和过氧化氢应激试验反映SigE对应激的影响。DDP和MMC作用后观察SigE对DNA损伤应激的影响。3.设立含空质粒转化菌为对照组,采用刃天青作为指示剂的微量滴定板法和菌落计数法检测细菌的生存率反映细菌对抗结核药物的敏感性。4.构建sigE基因缺失突变体,验证缺失sigE基因对耻垢分枝杆菌药物敏感性影响,同时构建p MV261-MSMEG-5071/MS重组耻垢分枝杆菌过表达“抗SigE”分子,验证抑制SigE时,对耻垢分枝杆菌药物敏感性影响。5.采用相应抗生素处理重组耻垢分枝杆菌48 h诱导细菌进入非复制持留状态,随后在含20 ng/m L的结核分枝杆菌复苏促进因子E的7H9中静置培养2周,计数最大可能数和细菌生长数,测算复苏指数来了解SigE对药物敏感性的影响机制。6.高通量测序分析差异基因的表达情况,参考基因注释、聚类、功能富集分析。结果:1.成功构建p MV261-SigE,经测序鉴定序列正确,Western blot检测到SigE在耻垢分枝杆菌中成功表达。2.与空载菌株比较,SigE过表达菌株在十二烷基硫酸钠、酸和过氧化氢应激下生存率更高(P<0.05);顺铂作用后,耻垢分枝杆菌SigE表达水平比未处理对照组高,顺铂或丝裂霉素c处理的SigE重组耻垢分枝杆菌组存活率也更高(P<0.05)。3.与对照组相比,SigE过表达耻垢分枝杆菌组对抗结核药物的相对荧光百分比高,即敏感性下降。4.成功构建sigE基因敲除质粒和p MV261(+)-MSMEG-5071/MS质粒,MSMEG-5071(抗SigE)成功表达。表达MSMEG-5071的重组耻垢分枝杆菌对抗生素的敏感性增加。但耻垢分枝杆菌sigE基因突变体仍需进一步筛选鉴定。5.异烟肼、乙胺丁醇两种药物作用后,SigE过表达耻垢分枝杆菌复苏指数明显高于对照组;MSMEG-5071过表达菌持留复苏指数除链霉素外,其他五种药物都表现出复苏指数低于对照组。6.高通量测序,差异基因分析显示MSMEG-5071过表达菌在药物处理后虽然调动应激等机制,但同时生理代谢旺盛,降低群体感应基因的表达。结论:1.DNA损伤剂作用后,SigE表达量升高,SigE过表达耻垢分枝杆菌有较强的抗应激和抗DNA损伤的能力。2.SigE可能是通过促进耻垢分枝杆菌进入持留状态影响异烟肼和乙胺丁醇作用的敏感性。3.MSMEG-5071对减少持留菌的产生发挥了重要作用。