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特定核酸或基因序列的检测在临床诊断,基因突变,生物防卫等领域有着至关重要的应用价值。近年来,研究者一直致力于发展更灵敏和简便的生物传感器技术用于特定核酸的检测。其中,荧光生物传感器具有操作简单、选择性好、响应快速等优点而成为重要的研究方向。然而,目前的荧光生物传感器技术大多需要标记和借助纳米材料来达到进行信号放大的目的。本研究设计了三种无需标记和纳米材料就能实现信号扩增的荧光生物传感器,并对其可行性、工作条件和性能开展了详细地研究,为开发出灵敏度高、操作简单和成本低廉的荧光生物传感器具有重要的参考价值。主要结果如下:1.基于核酸外切酶III(Exo III)介导的级联荧光信号放大策略,构建了一种无需标记的荧光生物传感器,实现了对金黄色葡萄球菌mecA基因的高灵敏度和操作简便的检测。该设计中发夹探针(hairpine probe,HP)作为识别元件和信号报告元件,行使着目标序列识别和信号报告的功能;当mecA目标基因不存在时,HP不能被Exo III消化,因而富含G的核酸序列被限制在HP探针的茎端;当存在mecA基因时,会与HP互补杂交形成3’为平末端的双链,引起Exo III的消化反应,释放出mecA基因和mecA基因的类似物;被释放的mecA基因及其类似物能与其他的HP探针杂交,激发新一轮的切割反应,从而不断地产生G-四联体,这些G-四联体特异地与荧光染料N-甲基间卟啉IX(NMM)结合产生强烈的荧光信号。研究表明,该检测平台对mecA基因表现出很高的灵敏度,在不需要任何标记、固定和洗涤步骤的条件下其检测极限低至2.4 fM;在其他干扰DNA存在的情况下,该检测体系对mecA基因表现出了优异的选择性;在检测食物样品牛奶中的mecA基因时也获得了满意的结果。2.基于支点激活的链置换反应(TMSDRs)介导的级联荧光信号放大信号放大策略,构建了一种简便的生物传感器用于检测HIV-1基因。该体系中待检测的HIV-1基因与核酸探针LS的末端区域进行支点介导的链置换反应,导致了新的支点区域的暴露。核酸探针FS随后杂交到该区域上,通过支点介导的链置换反应释放G-四联体序列和目标HIV-1基因。这样HIV-1基因就可以循环再利用,使得体系中释放出大量的G-四联体序列。这些被释放的G-四联体序列与荧光染料NMM结合产生显著的荧光信号。研究表明,该检测平台对HIV-1基因表现出很高的灵敏度,在不需要任何标记、固定和洗涤步骤的条件下其检测极限低至1.9 pM;该体系在其他干扰DNA分子存在的情况下也对HIV-1基因的检测展示出了优异的选择性;在实际生物样品中能成功用于HIV-1基因的检测,并获得了满意的结果,因而可以用于HIV感染者的早期简便的临床诊断。3.基于三向DNA连接体引导的催化发夹组装构建的免标记荧光生物传感器,实现了对Kras基因的检测分析。在该检测体系中,设计了一个三向DNA连接探针(junction probe,JP)和两个发夹探针(H1和H2)。其中两条DNA链(S1和S2)一旦连接就会激活具催化活性的发夹结构的组装,待检测的Kras基因能与S1和S2通过碱基互补被共识别,形成三向结构的探针JP。通过支点介导的链置换反应,探针JP与发夹探针H1杂交,导致了新的支点区域暴露。一旦与新的支点杂交,发夹探针H2就会替代探针JP并释放G-四联体。因此,探针JP就可以循环再利用,使得体系中释放出大量的G-四联体序列,而不断被暴露的G-四联体与荧光染料NMM结合产生显著的荧光信号用于靶基因的检测,研究表明,该检测平台对Kras基因表现出很高的灵敏度,在不需要任何标记、固定和洗涤步骤的条件下其检测极限低至2.7 fM;该系统在其他干扰DNA分子存在的情况下对Kras基因的检测展示出了优异的选择性,并实际生物样品中野生型Kras基因的检测中成功得到应用,从而暗示该方法可以用于遗传疾病的早期简便的临床诊断。