死亡受体属于肿瘤坏死因子受体基因超家族成员，可传导由特定的死亡配体引起的凋亡信号。激活这些受体的配体属于肿瘤坏死因子超基因家族。FasL是Fas在体内的天然配体，膜结合型和可溶性的FasL均可与Fas交联，并诱导Fas三聚体的形成，继而导致Fas分子膜质区的死亡域与另一种具有死亡结构域的Fas相关蛋白结合，促使FADD N端的死亡域与胱天蛋白酶8酶原相互作用并激活Caspase-8，最终导致表达Fas的细胞呈生理性死亡。 FasL基因编码的产物是一种介导细胞凋亡的重要跨膜蛋白，其表达调控涉及多种转录因子的参与。胞外刺激因素可通过调节多种与FasL相关的转录因子的表达或活性来影响FasL的表达水平，并最终导致靶细胞的凋亡。在T细胞中，FasL的表达主要是受NFAT调控，其过程涉及到在Ca<’2+>或及钙调蛋白的参与下，经钙调神经磷酸酶激活的一系列步骤。免疫抑制剂环胞菌素A可抑制CaN的活性，使NFMT的去磷酸化反应及向核内转移的过程受阻，最终影响其对FasL表达的调控。 本研究分为四个部分： 第一部分：Ca<2+>／CaN依赖的信号通路参与皮质酮诱导的MLTC凋亡中FasL的表达 先前的研究结果使得在以MLTC作为细胞模型的本研究中，为阐明在皮质酮处理的Leydig细胞中有关NFAT调控FasL表达的机制，需先证实在皮质酮诱导的MLTC凋亡中同样有Ca抖浓度升高、增加的CaN活性和FasL表达量及存在NFAT表达的事实。 用流式细胞仪检测经Annexin V-FITC／PI双标的Leydig细胞，结果显示：经100nM皮质酮处理的MLTC的凋亡率较未处理组有显著增加。经CsA和皮质酮共同处理的细胞，其凋亡率则显著减少。将经100nM皮质酮处理的MLTC基因组DNA提取后，经琼脂糖凝胶电泳分析发现，存在凋亡特有的DNA ladder条带。利用钙定性探针Fluo-3／AM检测发现，经100nM皮质酮处理的MLTc，其Ca<2+>浓度显著增加。采用酶底物法测定细胞中CaN活性发现，经100nM皮质酮处理的MLTC，其CaN活性显著升高，但这一升高的活性可被CaN的抑制剂CsA抑制。用RT-PER和Wes ternblot检测经100rN皮质酮处理的MLTC中FasL的表达，结果表明：处理组FasL mRNA和蛋白表达水平与未处理组相比均呈显著增加。经皮质酮和CsA共同处理的细胞，其FasL mRNA和蛋白表达水平则与对照组无显著差异。用RT-PCR和Western blot方法检测发现：在MLTC中有NFAT2的表达，证实该细胞表达NFAT2。 本部分的实验结果提示：在MLTC中可能同样存在Ca<2+>／CaN依赖的信号通路，因细胞经高浓度皮质酮处理后，ca<2+>和CaN的变化与细胞中FasL的表达呈正相关。尤其是证实了转录因子NFAT2在MLTC中也有表达。 第二部分：FasL启动子报告载体的构建及其活性分析 本部分的研究是通过构建含有FasL启动子的荧光素酶报告载体来观察在皮质酮处理的Leydig细胞中，调控FasL的表达是否发生在转录水平。并由此确定FasL启动子的核心序列，此可为进一步研究调控区中顺式作用元件的位置及与之相互作用的反式作用因子的种类和功能，并为最终阐明调控FasL表达的机制提供可能。 首先提取小鼠基因组DNA，利用PCR方法扩增了长度为689bp的FasL基因5’非编码区片段，在此基础上再分别扩增长度为329bp、272bp、238bp、209bp及138bp的5’非编码区片段。将上述片段分别与pGL3-Basic载体连接，构建成含有FasL启动子的荧光素酶报告载体。利用脂质体将含有不同长度的FasL启动子报告载体瞬时转染入经100nM皮质酮处理的Leydig细胞，经荧光素酶活性检测发现：不同的报告载体均能显示出不同程度的表达活性。 本部分的实验结果表明：含有FasL启动子的荧光素酶报告载体已被成功构建。在经高浓度皮质酮处理的Leydig细胞中，FasL启动子的核心调控元件位于-201-+71范围内。 第三部分：NFAT活性的初步研究 在免疫系统中，NFAT对FasL表达的调控作用取决于前者能否被活化。活化的NFAT从胞浆移至核内，与FasL启动子结合、相互作用。因此，评价NFAT在皮质酮处理前后的Leydig细胞中的定位情况是分析其功能的前题。在本部分的工作中，我们用EGFP标记法观察皮质酮处理前后的Ieyidg细胞中NFAT2的位置改变情况。此外，我们还构建了表达NFAT2的细胞株，此可为进一步研究NFAT调控FasL的表达机制提供帮助。 利用RT-PCR方法从淋巴细胞中扩增NFAT2的编码序列，经测序鉴定证实该序列与文献报道一致后，将其与真核表达载体pEGFP-C1连接，构建pEGFP-NFAT2融合的表达载体。挑取阳性克隆后进一步测序，经分析证实未出现移码后，将其瞬时转染Leydig细胞，提取细胞内总RNA后，采用RT-PER分析表明：该表达载体可用于介导NFAT2在Leydig细胞中进行有效表达。将pEGFP-NFAT2表达载体转染Leydig细胞，于36h时经100nM皮质酮处理，48h时用激光扫描共聚焦显微镜观测NFAT2在细胞内定位发现，Leydig细胞经皮质酮处理后，细胞内的NFAT2从胞浆移向胞核。此外，我们将所构建的pcDNA3-l-NFAT2表达载体转染Leydig细胞后，经G418加压筛选，用RT-PCR和Western blot方法筛选阳性克隆，获得了能稳定表达NFAT2的细胞株。 研究结果表明：经100nM皮质酮处理后的Leyidg细胞，其中的NFAT2在细胞内的定位有一个动态变化过程。而经皮质酮和CaN抑制剂CsA共同处理的Leydig细胞，其NFAT2仍停留于胞浆中，未出现向核内移动的现象，故不会引起FasL表达的上调。可见，NFAT2在细胞内的移位对其功能发挥起着重要作用。 第四部分：NFAT调控FasL的表达及其机制的研究 在上述三部分的工作中，我们证实了经皮质酮处理的Leydig细胞中有Ca<2+>／CaN依赖的信号通路的参与(即：有增加的Ca<2+>水平和CaN活性，NFAT2的表达和增加的FasL表达量)。确定了经皮质酮处理的Leydig细胞中FasL启动子的核心调控元件。完成了对NFAT2活性的初步分析。在此基础上，将进一步研究NFAT2是否确实参与对FasL表达的调控及其可能的作用机制。 本部分的内容，一是证实了转录因子NFAT2在小鼠肿瘤Leydig细胞中有表达的基础上，我们首先利用稳定表达NFAT2的细胞株作为细胞模型，观察经皮质酮处理的Leydig细胞中FasL mRNA及蛋白质的表达水平，同时测定上述情况下细胞的凋亡率。结果显示：经皮质酮处理后细胞株中FasL的mRNA和蛋白水平均显著上升。皮质酮和CsA共同处理组中的FasL mRNA和蛋白水平与未处理组相比则无显著变化。Leydig细胞经100nM皮质酮处理12h，其凋亡率显著增加，若将皮质酮和CsA共同处理Leydig细胞，则凋亡率显著减少，表明：NFET2参与了皮质酮诱导的Leydig细胞凋亡的过程。此外，采用RNA干扰技术评价在NFAT2的表达受到干扰的情况下，检测FasL mRNA及蛋白质的表达量发现： NFAT2表达受到抑制后，经100nM皮质酮处理Leydig细胞中FasL的表达未呈现显著上调。进一步证实NFAT2参与了皮质酮诱导的Leydig细胞凋亡的过程。 在证实了NFAT2对FasL表达具有调控作用的基础上，本部分的第二项内容是进一步评价有关NFAT2调控FasL表达的机制。我们采用共转染和突变分析实验来研究在皮质酮处理的Leydig细胞中，NFAT2是否通过调控FasL启动子活性来控制FasL的表达。利用脂质体将FasL启动子荧光素酶报告载体pGL3一FLP272一luc和NFAT表达载体pcDNA3.1-NFAT2瞬时共转染Leydig细胞，经荧光素酶检测发现：经100nM皮质酮处理12h的Leydig细胞，其荧光素酶活性与未处理组相比呈显著增高，表明：NFAT2对FasL启动子具有明显的调控作用。此外，我们设计了FasL启动子上NFAT结合位点的突变引物，用PCR方法，扩增该突变片段，即：272bp的FasL5’非编码区片段，经测序鉴定后，将其与pGL3一Basic载体连接，构建FasL启动子上NFAT结合位点突变的荧光素酶报告载体。利用脂质体将pGL3一FLP272mut—luc和NFAT表达载体pcDNA3.1-NFAT2瞬时共转染Leydig细胞，经荧光素酶检测发现：经皮质酮处理12h的Leydig细胞，其荧光素酶活性与未处理组相比无显著差别。上述结果进一步表明，NFAT2对FasL启动子具有显著的调控作用。本文最后一部分的工作表明，在皮质酮处理的Leydig细胞中，NFAT2通过和FasL启动子核心序列中的NFAT结合位点结合调控FasL的表达。