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[背景与目的]多发性骨髓瘤(multiple myeloma,MM)是一种单克隆浆细胞异常增生的恶性肿瘤,以分泌大量单克隆免疫球蛋白,造成组织器官损害为特征。靶向P13K/Akt/mTOR信号通路治疗MM的研究结果己受到广泛关注,并有研究证实Akt不同表型的骨髓瘤细胞株对特定靶向药物的敏感性存在差异。课题组前期研究已经湘证实,,与骨髓瘤细胞株U266细胞相比,H929细胞的基线p-Akt水平较高,体外对冬凌草甲素(Oridonin,ORI)更为敏感,诱导细胞凋亡,其分子机制可能与下调Akt上游分子PI3K的磷酸化水平以及p-Akt(s)的表达有关。本研究基于课题组在中药有效成分体外干预骨髓瘤细胞株取得的良好研究结果,借鉴青蒿琥酯(Artesunate,ART)已被证实的抗肿瘤活性,以人骨髓瘤细胞株H929和U266细胞为研究对象,一定浓度ART体外处理H929和U266细胞,观察ART对骨髓瘤细胞增殖、凋亡及自噬的影响,探讨可能的分子机制,进一步评价基线Akt水平对ART诱导的不同骨髓瘤细胞增殖的效应。[方法]1.0、1、2、5、10、20、40μg/ml ART体外分别干预H929和U266细胞12、24、36、48、72h,噻唑蓝(MTT)法检测对细胞增殖的影响。2.0、2、10、20μg/ml ART干预 H929和 U266细胞48h,采用 TUNEL+DAPI染色、AnnexinV-FIFC/PI双染流式细胞术(flow cytometry,FCM)检测细胞形态或细胞凋亡率的变化。3.0、2、10、20μg/ml ART 干预H929和U266细胞48h,Western Blot 检测caspase-3、PARP、PI3K/Akt/mTOR通路蛋白(PI3K p100p、p-Akt(s)、p-Akt(t)、mTOR、p-mTOR),自噬相关蛋白Beclinl LC3、p62的表达。4.20μg/ml ART分别联合自噬抑制剂3-MA和自噬激动剂雷帕霉素RA PA干预H929和U266细胞48h,Western Blot检测caspase-3、PARP、P13K/Akt/mTOOR通路蛋白(PI31K p110β、Akt、p-Akt(s)、p-Akt(t)、mTOR、p-mTOR),自噬相关蛋白 Beclinl、LC3、p62的表达。[结果]1.一定浓度ART在体外可有效抑制H929和U266细胞增殖,抑制率与时间、浓度呈正相关(P<0.01)。2、10、20μg/ml ART处理H929细胞48h,增殖抑制率为20.82%±1.64%、31.75%±1.70%、38.92%±2.15%;U 266 细胞增殖抑制率分别为 53.95%±1.58%、61.79%±1.40%、72.21%±1.83%,两者比较,ART对U266细胞增殖抑制强于H929细胞,差异具有统计学意义(P<0.01)。2.2、10、20μg/ml ART干预H929和U266细胞48h,荧光显微镜观察到细胞核皱缩、核解体;TUNEL阳性率呈浓度依赖性递增(H929细胞:4.50%±0.26%,20.46%±1.49%,44.56%±1.27%;U266 细胞:10.25%±0.79%,40.67%±2.89%,70.79%±2.11%)。流式细胞术检测细胞早期凋亡率呈浓度依赖性递增(H929细胞:12.2%±0.75%,19.46%±0.68%,44.30%±0.81%;U266 细胞:19.50±0.80%,21.60%±0.88%,56.67%±1.46%,提示一定浓度ART呈浓度依赖性诱导细胞凋亡(P<0.01),且U266细胞较H929细胞更为显著(P<0.01)。3.2、10、20μg/ml ART干预H929和U266细胞48h,Western Blot结果提示:cleaved caspase-3、cleaved PRAP、Beclin1、LC3B、p62表达在两株细胞中均呈浓度依赖性递增,而p-AKT、p-mTOR表达递减,PI3K p110β无显著改变,提示ART可抑制Akt和mTOR磷酸化、增强细胞自噬水平。4.进一步采用20μg/ml ART联合自噬抑制剂3-MA或自噬激动剂RAPA,发现相比单独ART处理组,两株细胞ART+3-MA组cleaved caspase-3、cleaved-PARP表达均下调,ART+RAPA组cleaved caspase-3、cleaved-PARP、Beclinl、LC3B表达均进一步上调,p-AKT、p-mTOR表达完全受抑,提示ART在诱导细胞凋亡同时,可诱发H929细胞及U266细胞自噬性死亡。[结论]一定浓度ART在体外能有效抑制H929和U266细胞增殖,诱导细胞凋亡,其可能的分子机制与下调PI3K/Akt/mTOR信号通路相关;一定浓度ART还可诱导骨髓瘤细胞株H929和U266过度自噬,从而协同促进细胞死亡。