家蚕作为重要的特种经济动物和鳞翅目昆虫研究模型,其肠道内数量庞大、种类繁多的微生物在宿主的多种生命活动中扮演着重要角色。目前,国内外对家蚕肠道内细菌的多样性进行了广泛研究,葡萄球菌作为家蚕肠道微生态系统的重要组成部分,在种水平上对其种群、致病性以及产消化酶相关功能的研究鲜有报道。对此我们进行了以下实验:分别对桑叶和人工饲料饲养的2龄家蚕以及桑叶饲养的5龄家蚕肠道细菌进行高通量测序分析,包括OTU分析、Alpha多样性分析、Beta多样性分析、物种注释及分类学分析、LEfSe分析、相关性分析及KEGG通路分析,探讨了饲料和龄期的不同对家蚕肠道细菌多样性的影响,以及其中的葡萄球菌属的丰度分布差异;采用纯培养方法,分别对不同饲料饲养(桑叶和人工饲料)、不同龄期(2龄和5龄)和不同地区(重庆、四川、广西和云南)的家蚕肠道葡萄球菌进行分离纯化,然后进行菌落形态学鉴定、16S rDNA分子鉴定及系统发育分析,分析了不同饲料饲养、龄期和地区家蚕肠道葡萄球菌的种间差异;通过高浓度添食家蚕的方式,对从家蚕肠道分离的不同葡萄球菌在家蚕肠道内是否有致病性进行了检测;使用4种筛选培养基对产消化酶(蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶和纤维素酶)的家蚕肠道葡萄球菌进行筛选,并比较了不同葡萄球菌产消化酶活性的差异。本实验的主要研究结果如下:1.对家蚕肠道菌Alpha多样性进行分析,发现饲料对家蚕肠道细菌丰度的影响不显著,且肠道菌的丰度随着龄期增长而下降;相比桑叶饲养,人工饲料饲养家蚕肠道细菌种类的多样性更高,同时桑叶饲养的家蚕肠道菌的多样性随龄期增长而出现降低。分析Beta多样性后也发现,同一龄期,桑叶和人工饲料分别饲养的家蚕肠道菌多样性相似;而从2龄到5龄,家蚕肠道菌在多样性上变化明显。从不同分类学水平家蚕肠道菌的丰度变化发现,龄期的改变对家蚕肠道菌的丰度影响较大,尤其是在5龄期的桑叶育家蚕肠道内甲基杆菌和Aureimonas丰度很高;在同一龄期,桑叶和人工饲料饲养的家蚕肠道优势菌属丰度更为接近,而不同龄期家蚕肠道优势菌属在丰度上差异明显。对于本研究的主要对象葡萄球菌属,在所有检测到的32个总菌群中占比不超过1%,丰度为中低水平,其中桑叶育2龄和5龄家蚕肠道葡萄球菌丰度比较接近,分别为0.59%和0.53%,但均显著低于人工饲料育葡萄球菌丰度为0.87%的水平;LEfSe分析显示,同样以桑叶饲养,不同龄期家蚕肠道内有显著差异菌群较多,远远高于同一龄期不同饲料饲养家蚕肠道内差异菌群数。通过高通量测序组学分析的结果表明:相比饲料,龄期对家蚕肠道菌物种多样性、丰度及差异菌群的数量影响更大,家蚕生长发育过程中的一系列生理功能上的变化,在很大程度上对肠道菌的结构产生了影响;此外,相关性分析表明桑叶育2龄家蚕肠道细菌间有着更好的协同作用及共生关系。KEGG功能预测结果也显示,家蚕肠道细菌在涉及物质的代谢以及转运等代谢途径上可能扮演着重要作用,同时龄期和饲料的变化并未显示出家蚕肠道菌表现有显著差异的功能基因,体现了家蚕肠道菌在功能上的稳定性。2.关于葡萄球菌的种群鉴定,16S rDNA分子鉴定和系统发育分析的结果表明,分离的种类在种水平上分别与鸡葡萄球菌、松鼠葡萄球菌、腐生葡萄球菌、木糖葡萄球菌和琥珀葡萄球菌有较高的同源性(99.68%～100.00%),并为主要的家蚕肠道葡萄球菌;在菌落形态学特征上,除了不同种的葡萄球菌间存在差异外,同种的不同菌株间菌落形态也不尽相同,显示葡萄球菌在菌落形态上的多样性与其基因型上的分化有着一定相关性;比较不同影响因素下家蚕肠道葡萄球菌的种间差异,发现相比龄期和地区,饲料对葡萄球菌种间差异影响较大,其中桑叶育的家蚕肠道葡萄球菌物种的种类上明显高于人工饲料育的家蚕,桑叶可能对家蚕肠道葡萄球菌物种多样性的维持起着积极作用;此外松鼠葡萄球菌类和鸡葡萄球菌类在各实验组家蚕肠道内均能检测到,推测这两类葡萄球菌可能起着某些不可或缺的生物学作用。3.致病性试验结果显示,从家蚕肠道分离的各种葡萄球菌包括分离的一株金黄色葡萄球菌通过3个高剂量梯度(1×10~7 CFU/头,1×10~8 CFU/头和1×10~9 CFU/头)经口添食2龄起蚕,在家蚕肠道内均未能显示出明显的致病性,说明在正常饲养情况下,葡萄球菌可以作为家蚕的一类安全共生菌定植在肠道;关于葡萄球菌如金黄色葡萄球菌能否通过创伤等其他方式进入血腔对家蚕表现出致病性需要做进一步的研究。4.产消化酶功能的研究结果显示:家蚕肠道葡萄球菌可产蛋白酶和脂肪酶,但不产淀粉酶和纤维素酶,本研究从65株葡萄球菌中筛选到47株产消化酶的菌株,其中40株产蛋白酶,13株产脂肪酶,同时产蛋白酶和脂肪酶的有6株,4种消化酶均不产的有18株,未筛选出产淀粉酶和纤维素酶的葡萄球菌。重庆人工饲料组(SWF)的葡萄球菌菌株产蛋白酶比例最高,达到了100%,四川桑叶组(SCM)的产蛋白酶比例最低,为30.77%;在产脂肪酶上广西桑叶组(GXM)的比例最高,为44.44%,重庆桑叶组(SWM)的比例最低,仅为7.14%;此外不同葡萄球菌菌株分泌的蛋白酶和脂肪酶在活性能力上差异明显。其中产蛋白酶葡萄球菌的酶活性大小(水解圈直径与菌落直径之比值)为5.39±2.75,活性最高菌株为松鼠葡萄球菌SW158,比值为10.11±0.60;产脂肪酶葡萄球菌的酶活性大小为14.44±16.62,活性最高菌株为腐生葡萄球菌GX2,比值为50.33±4.47。综上结果表明:葡萄球菌在家蚕肠道中具有广泛的种群分布,但在家蚕肠道所有菌群的组成上其丰度为中低水平;从家蚕肠道分离的葡萄球菌菌株多数分别与鸡葡萄球菌、松鼠葡萄球菌、腐生葡萄球菌、木糖葡萄球菌和琥珀葡萄球菌有较高的同源性;所分离的葡萄球菌均对家蚕肠道无致病性作用;家蚕肠道葡萄球菌可产蛋白酶和脂肪酶,但不产淀粉酶和纤维素酶,菌株在遗传生态学上的分化显著影响其产酶的活性,不同种的葡萄球菌菌株其产消化酶活性上的差异可能涉及到对家蚕肠道消化与营养生理作用的影响。此外,松鼠葡萄球菌类和鸡葡萄球菌类菌株在所有不同试验组的家蚕肠道内均能检测到,推测葡萄球菌对家蚕肠道可能还有一些其他不可或缺的生物学作用和意义。