研究背景:肝细胞癌（hepatocellular carcinoma,HCC）占肝部癌症的90%,剩下的是肝胆管癌。肝细胞癌是世界范围内常见的一种癌症,其死亡人数逐年上升。在欧洲,酒精滥用大概导致了约一半的肝癌患者,而在中国病毒感染则是导致肝癌的主要原因。随着肝炎病毒逐渐得到控制,酒精导致的肝癌患者逐年增加。肝细胞癌常始于肝硬化,并逐渐成为世界范围内第二大致死癌症。它起病隐袭,往往早期诊断困难。目前治疗肝细胞癌的方法主要有早期发现的治愈性手术,局部介入治疗以及放化疗等。尽管诊断与治疗技术不断进步,但是仍然大约有60%的病人在发现时已经是晚期,导致死亡率居高不下。随着分子生物学的发展,人们发现肝癌的发生、发展与基因表达有密切的关系。在基因转录翻译的各个环节的异常都对肝细胞癌的发生,发展起到重要作用。比如组蛋白去乙酰化酶（HDAC）家族的SIRT2就在肝细胞癌中明显升高,并且对肝细胞癌的发生发展起到重要的作用。因此研究肝细胞癌的发生发展的分子机制以及免疫过程可能为攻克此疾病提供重要手段。基因表达是指基因指导下的蛋白质合成过程。包括转录,翻译等步骤。而在转录过程中,基因的剪接过程也对基因表达起着关键性的作用。众所周知,基因包括外显子和内含子,而由一条DNA链转录形成的RNA称为前mRNA（pre-mRNA）,又称核内异质 RNA（heterogenous nuclear RNA,hnRNA）。而此时的前 mRNA 是包含有外显子与内含子以及编码区前面及后面非翻译序列的,把内含子去掉,把外显子整合在一起的过程就是基因剪接过程。剪接的位点位于外显子3’末端的GT和内含子3’末端与下一个外显子交界的AG处。选择性剪接（alternative splicing）是指对于前mRNA中的外显子进行选择性的结合或去除来形成不同的成熟mRNA的过程。选择性剪接是转录后调节的一种重要方式,对于蛋白多样性和基因组学研究具有重要意义。选择性剪接往往不断的发生于生物的生理活动中,通过决定基因组表达来对于外界刺激发生反应。而选择性剪接的实现需要位于可变外显子与侧翼内显子的顺式和反式作用剪接因子的参与。选择性剪接的改变可以导致很多疾病的发生,而人为控制选择性剪接的过程也用于很多的领域内。已知的研究表明选择性剪接与肿瘤,神经性疾病,血液性疾病等的发生、发展有关。选择性剪接可以影响蛋白功能的各个方面,使之成为了基因表达的一个核心环节。因为它会影响几乎所有基因表达,所以目前的研究只是其功能的冰山一角。目前选择性剪接在肿瘤中的改变被大量研究,而且选择性剪接的失调被认为是癌症发生的标记。已经有研究表明剪接因子SF2/ASF可以控制与上皮间质转换（EMT）有关的外显子,而EMT则在肿瘤细胞的侵袭性上有重要影响。由于大部分的肿瘤都是厌氧糖代谢,所以有研究表明选择性剪接与肿瘤中糖代谢有关的酶表达有关,比如:丙酮酸激酶。大部分的肿瘤细胞中PH值较低,而酸性环境可以促进剪接因子从细胞核运输到细胞质中。比如在缺氧或者人为酸性条件下,剪接因子tra2/betal将在胞质中聚集,这可能也与肿瘤的发生、发展有关。所以癌症中肿瘤细胞微环境的改变可能会引起选择性剪接的失调,这样可能会通过影响某些蛋白的表达来引起肿瘤的发生、发展。总之,已经有研究表明选择性剪接发生于肿瘤发生、发展的各个方面,如:细胞增殖,细胞凋亡,细胞侵袭,甲基化缺失以及对化疗药物耐药等。因此选择性剪接是最近研究的热点,但是它在肝细胞癌发生发、展中的作用仍然不明确。选择性剪接是受序列特异性RNA结合蛋白（RBPs）与前mRNA结合能力控制的。每个选择性剪接的过程受许多RBPs蛋白的共同影响,而且其作用是相互的可能既有协作也有竞争作用。在更高级的真核细胞中,SR蛋白被认为是最有特点的剪接蛋白。他们既作用在基本的前mRNA的剪接过程也作用于选择性剪接过程,因此他们的功能与其他RBPs相比更加独特。SR蛋白的RNA识别模序（RRM）包括一个RNA结合蛋白位点,同时还有一个富含精氨酸/丝氨酸的RS区域。而这两个结构都是剪接体的重要组成部分,其中RRM可以起到RNA识别和结合的作用,而RS区域则是蛋白-蛋白相互作用的位点。但是也有研究表明RRM与RS的作用并不是绝对的,也可能存在交叉。人们普遍认为SR蛋白调节选择性剪接是通过结合外显子剪接增强子（ESEs）来实现的。通过这种机制可以选择性剪接一些弱的剪接位点。hnRNP A/B被认为是可以增强SR蛋白的这种作用。剪接因子SRSF2是SR蛋白家族中的一员。也是目前研究比较的多的一种SR蛋白。它也具有SR蛋白一般的特点具有RRM和RS区域,通过结合ESE来起到正调节选择性剪接的作用。除此之外SRSF2还在转录活化,RNA稳定,mRNA运输以及mRNA翻译过程中起作用。有研究表明特异性敲除SRSF2会导致小鼠急性肝功能衰竭和早亡。因此剪接因子SRSF2在肝脏代谢中起到重要作用。另外人们还发现转录因子也参与到肝胆酸代谢和能量稳态中。此研究表明剪接因子在肝脏功能中起到重要作用,但是它在肝脏肿瘤发生、发展中的作用并没有明确研究。而且对于剪接因子SRSF2在肝细胞癌的临床表现中的作用没有研究,我们首次研究了剪接因子SRSF2与肝细胞癌的临床分期,肿瘤分化程度以及甲胎蛋白水平之间的关系。研究目的:1、剪接因子SRSF2在人肝细胞癌与对应的相邻正常肝组织内的表达情况。2、剪接因子SRSF2蛋白表达与人肝细胞癌临床病理特征之间的关系分析。3、剪接因子SRSF2蛋白表达与人肝细胞癌临床分期以及血清甲胎蛋白水平之间的关系分析。4、剪接因子SRSF2蛋白表达与肝细胞癌患者生存时间之间关系分析。研究方法:第一部分:SRSF2在人肝细胞癌与对应的相邻正常肝组织内的表达情况。1.1标本收集我们收集了从2010年一月至2013三月在齐鲁医院行外科治疗的共153例肝细胞癌患者。选取其肝细胞癌组织与正常的癌旁组织。这些病人术前都没有进行放化疗或者生物学治疗,并且所有的患者病理都确诊为肝癌患者。在手术切除病变组织后,选取合适大小的切除组织送病理科做石蜡切片并行病理诊断,并选取黄豆粒大小的组织立刻放入液氮冷冻。此选材过程不存在伦理学争议,并提前告知病人及家属,取得对方同意。1.2标本中剪接因子SRSF2在临床标本中的表达情况。1.2.1用免疫组化（IHC）的方法对临床标本进行染色。按照商业试剂盒的使用方法对福尔马林固定的标本进行染色。用PBS作为阴性对照抗体。每张福尔马林切片至少选取5个视野进行观察,记录阳性细胞的百分数及染色情况（剪接蛋白SRSF2只表达于细胞核中）。用下列标准来进行免疫组化积分:通过计算阳性细胞百分比来对免疫组化进行评分：通过整体染色情况来对免疫组化的染色切片进行评分：最终的积分（A）是阳性细胞百分比评分乘以染色情况积分并取平均值。最终判断标准是：1.2.2用Western blot的方法对选取的肿瘤组织和肿瘤旁组织进行剪接蛋白SRSF2表达水平检测。选取存入液氮的组织按照商用试剂盒的说明提取肿瘤组织和对应的瘤旁组织的总蛋白。选取100微克总蛋白进行蛋白电泳,待条带清晰分开后,把目的条带用湿转法转到湿NC膜上。用5%脱脂牛奶进行封闭,然后用SRSF2抗体浸没,4℃过夜。TBST洗膜后,用二抗室温反应1小时。ECL显色,条带灰度用Image-J软件进行分析。第二部分:剪接因子SRSF2蛋白表达与人肝细胞癌临床病理特征之间的关系分析。用SPSS20.0统计软件分析SRSF2蛋白表达与人肝细胞癌临床病理特征之间的关系。2.1、剪接因子SRSF2蛋白表达与人肝细胞癌临床病理特征之间的关系分析。2.2、剪接因子SRSF2蛋白表达与人肝细胞癌临床分期以及血清甲胎蛋白水平之间的关系分析。2.3、剪接因子SRSF2蛋白表达与肝细胞癌患者生存时间之间关系分析。结果:1、剪接因子SRSF2在人肝细胞癌中是高表达的。2、剪接因子SRSF2的表达水平随着肿瘤分化程度的升高而升高。3、剪接因子SRSF2的表达与人肝细胞癌的TNM分期有关。4、剪接因子SRSF2的表达与人肝细胞癌的淋巴结转移和远处转移有关。5、剪接因子SRSF2的表达与人肝细胞癌患者甲胎蛋白水平成正相关。6、剪接因子SRSF2的表达水平可以影响人肝细胞癌患者术后生存时间。结论:1.剪接因子SRSF2在肝细胞癌组织中较癌旁正常组织显著高表达。2.剪接因子SRSF2在肝癌中的高表达与其临床病理特征之间存在显著性关系。3.高表达SRSF2会显著性降低患者术后生存时间。研究背景恶性肿瘤是目前影响人们健康的主要疾病之一,而胆管癌则一直因为其发病隐袭,症状不典型,发现后难以切除以及切除后易复发而成为了肝胆外科医生比较棘手的疾病之一。胆管癌是起源于胆管上皮的肝脏第二常见恶性肿瘤,根据其发病部位可以分为肝内胆管癌、肝门部胆管癌和远端肝外胆管癌。尽管随着早期诊断和规范化治疗的发展,外科医生对于该疾病的诊治水平得到很大的提高,但是其切除后复发率仍然很高,所以研究影响胆管癌预后的因素,以及可能的分子治疗耙点仍然十分重要。表观遗传学是现阶段分子生物学研究的热点之一,它是研究基因在核苷酸序列不发生改变的前提下,基因表达出现可遗传变化的一门遗传学分支。它主要包括DNA甲基化、RNA干扰、组蛋白修饰、染色质重组等。其中组蛋白乙酰化和去乙酰化修饰是组蛋白修饰的重要组成部分。而在此过程中就涉及到组蛋白乙酰化转移酶（HAT）和组蛋白去乙酰化酶（HDAC）的参与。目前发现的HDAC蛋白家族具有18种不同的亚型,而且具有不同的组织细胞分布,并且有不同的靶蛋白。通过调节靶蛋白的乙酰化状态调节基本细胞生物过程,包括基因表达,基因组稳定性,有丝分裂,营养代谢,老龄化,线粒体功能和细胞死亡等。Ⅲ型HDAC蛋白又被称为Sirtuin蛋白,它具有NAD+依赖性。目前人们已经发现了7种Sirtuin蛋白,它们都有一个由275个氨基酸组成的催化结构域。Sirtuin蛋白在细胞中处于不同的分布,比如SIRT6/7位于细胞核,而SIRT3-5则位于线粒体,SIRT1-2则分布于细胞核和细胞质中。SIRT2蛋白是Siftuin蛋白家族的一员,它在调节细胞代谢,氧化应激以及细胞迁移、凋亡等方面具有重要作用。虽然目前对于Sirtuin蛋白的研究不断发展,人们对于SIRT2蛋白的认识仍然是最少的。尤其是SIRT2蛋白在肿瘤发生,发展中的作用仍然是一个比较有争议的问题。SIRT2蛋白缺失在年老鼠中更容易诱发肿瘤。另外有报道认为SIRT2蛋白在人神经胶质瘤中表达降低,并且认为过表达SIRT2可以降低神经胶质瘤细胞系的集落形成能力。然而也有报道认为SIRT2蛋白在肝细胞癌中表达增加,而且这种过表达可以通过Akt/GSK-3P/P-Catenin信号通路介导上皮间质转化。另外在11例人胰腺癌中有6例是表达升高的,同时在人乳腺癌中也是表达升高的。有研究发现组蛋白去乙酰化酶抑制剂可以增加吉西他滨抗胆管癌细胞系HUCCT1的作用。所以SIRT2蛋白在肿瘤发生发展中的作用可能与肿瘤类型有关。但是SIRT2蛋白在胆管癌的发生发展中的作用及机制还没有人研究。我们首次对于胆管癌中SIRT2蛋白的表达以及可能的作用机制进行了研究。研究目的:1.探讨SIRT2蛋白在人肝内胆管癌组织中的表达情况。2.通过小RNA干扰的方法阻断胆管癌细胞系中SIRT2蛋白的表达来研究SIRT2蛋白在胆管癌细胞增殖,迁移和侵袭方面的影响。3.探讨SIRT2蛋白促进胆管癌发生发展的分子机制。研究方法及结果:1.我们选择8例在山东大学齐鲁医院行手术治疗的肝内胆管癌患者,收集切除的胆管癌组织及其周围的癌旁正常组织用蛋白免疫印迹检测其SIRT2蛋白的表达情况,没有病人在术前接受化疗与放疗及生物治疗。而且标本的收集都获得病人及家属的同意。病人肿瘤切除以后立刻放入液氮中进行保存。取适量组织于冰上用RIPA裂解液进行裂解获得全蛋白提取液,用BCA法进行浓度测定。取20μg总蛋白用12%SDS聚丙烯酰胺凝胶进行电泳分离。然后将蛋白转移到PVDF膜上,用5%脱脂牛奶进行封闭后,加一抗在4℃条件下孵育过夜。洗膜后加HRP标记二抗进行室温孵育。用ECL显色后,用软件进行条带灰度分析。在8例标本中,发现有7例肿瘤标本SIRT2蛋白较瘤旁组织明显升高。这提示我们在胆管癌组织中SIRT2蛋白表达水平是升高的。2.选择8例在齐鲁医院进行手术的肝内胆管癌及其癌旁正常组织进行免疫组化分析,按照试剂盒要求的实验步骤进行免疫组化染色后放在显微镜下观察。结果显示在肝内胆管癌组织中SIRT2蛋白表达水平明显升高。3.选取两个肝内胆管癌细胞系（FRH0201与QBC939）进行培养。细胞用1640培养基在37℃:,5%CO₂条件下进行培养。对SIRT2的降低表达是通过转染购买的SIRT2小干扰RNA（siRNA）来实现的。按照试剂盒的操作步骤严格进行,然后用蛋白免疫印记的方法检验对SIRT2蛋白的干扰效率。结果证明使用siRNA干扰48h以后,SIRT2的表达显著降低。然后用干扰掉SIRT2表达的细胞系进行胆管癌细胞系的行为学研究。3.1本课题研究了SIRT2干扰以后对于肿瘤细胞增殖能力的影响,而这个研究是通过MTT实验方法实现的。正常的细胞和siRNA干扰48h以后的细胞消化后,按照每孔5X103接种到96孔板中,在37℃,5%CO₂条件下进行培养24h。培养结束时每孔加入MTT（5 mg/ml）20uL,然后在37℃条件下再孵育4h。去掉MIT后,每孔加入DMS0 200ul,充分震荡后,在490nm处观察其吸光度的差异。结果表明在SIRT2千扰以后其增殖能力较正常对照与非转染组明显降低。3.2使用划痕实验研究了SIRT2蛋白干扰以后对于胆管癌细胞迁移能力的影响。不同组细胞接种于6孔板后,待生长至90%密度后,在每孔的中央用P200黄枪头划一直线。用生理盐水冲净碎片后培养24h后,用显微镜照相分析。结果表明SIRT2干扰以后其迁移能力较正常组和非转染组明显降低。3.3用Transwell小室迁移实验来检测SIRT2干扰后对肿瘤细胞侵袭能力的影响。在用胰酶将各组细胞消化为单细胞悬液以后,调整细胞浓度至5×10⁴/L,预先包埋好的小室中各接种100微升无血清的细胞悬液,在6孔板下室中加入含有10%血清的培养基,培养24h后,取出小室,用4%多聚甲醛固定后,用结晶紫染色在显微镜下观察,通过计数来评估SIRT2沉默对于胆管癌细胞侵袭能力的影响。结果表明SIRT2干扰后,其侵袭能力显著降低。3.4通过流式细胞术实验进行了SIRT2干扰对肿瘤细胞细胞周期及其凋亡影响的检测。根据细胞凋亡和细胞周期检测试剂盒的步骤要求进行实验,结果表明SIRT2干扰以后可以促进胆管癌肿瘤细胞系的凋亡,但对细胞周期没有显著影响。3.5最后为了揭示SIRT2干扰后抑制肿瘤细胞增殖,并且促进其凋亡的机制,我们用蛋白免疫印迹的方法检测了乙酰化的P53蛋白水平,结果表明在SIRT2干扰以后,细胞中乙酰化的P53水平明显升高。3.6以上实验每组都至少进行3次,实验结果用平均值土标准误来表示,然后用Graph Pad InStat软件进行统计分析。研究结论:1.在本研究中发现SIRT2蛋白在肝内胆管癌组织中表达明显升高。2.在肝内胆管癌细胞系中用小干扰RNA干扰SIRT2蛋白表达以后,可以抑制胆管癌细胞增殖,迁移和侵袭能力,并且可以诱导细胞凋亡,但对细胞周期没有显著影响。3.在肝内胆管癌细胞系中用小干扰RNA干扰SIRT2蛋白表达以后,乙酰化的P53蛋白水平明显升高,表明SIRT2可能是通过提高P53蛋白活性发挥其作用的。研究意义:胆管癌是起源于胆管上皮的第二常见的肝脏原发性肿瘤。由于其发病隐袭,对于该疾病的诊断是非常困难的。所以当阻塞性黄疸、乏力、体重减轻或不适等症状比较明显时,胆管癌可能己经发展到了晚期。在过去的数年里,此病在全球范围内发病率和死亡率不断升高。目前,肝门型胆管癌占所有疾病的50%-60%,而肝内和远端肝外型则占约20%,还有5%是多病灶的。因为此疾病的低切除率,高复发率以及对放化疗不敏感的原因,此疾病的预后非常差。因此目前尚缺乏对此疾病有效的综合治疗方法,并且胆管癌的侵袭和转移机制目前并不明确。最近SIRT2抑制剂被认为是治疗年龄相关疾病如神经性疾病和癌症的有效方法。而SIRT2在胆管癌中的作用目前尚无人研究。虽然SIRT2在许多肿瘤中的作用得到研究,但是其作用机制并不清楚。在此我们首次发现在肝内胆管癌组织样本中SIRT2表达显著升高,这表明SIRT2蛋白可能与胆管癌发生、发展有关。在干扰SIRT2表达以后,可以显著的降低肝内胆管癌细胞的侵袭、迁移能力,并且可以促进细胞凋亡。通过文献资料我们知道SIRT2可以降低P53的乙酰化状态并且降低其活性。我们通过实验也表明在SIRT2抑制以后,乙酰化状态的P53蛋白明显升高。这表明SIRT2的作用可能是通过对P53乙酰化状态的调节实现的。这些发现可能为我们诊断和治疗胆管癌提供新的分子靶点,同时对于特定HDAC抑制剂的研究具有促进意义。