研究背景及目的：冠心病在2013年最新公布的全世界死亡原因排名中再次高居首位。而急性冠脉综合征（acute coronary syndrome ACS）是冠心病致死率高的重要疾病类型。临床证据和病理学研究均表明，ACS发病的病理机制为动脉粥样硬化易损斑块的破裂。炎症、氧化应激反应、细胞外基质重塑能够加速动脉粥样硬化的进展；细胞外基质金属蛋白酶（matrixmetalloproteinases MMPs）活性升高带来的过度的细胞外基质的降解则是动脉粥样硬化斑块失稳定转变成为易损斑块的重要原因。易损斑块在病理上表现为富集巨噬-泡沫细胞的较大的脂质核心，以及较薄的纤维帽缺乏足够的平滑肌细胞保护。目前认为如果能够防止易损斑块的破裂从而减少血栓形成机率，冠状动脉粥样硬化疾病是一个相对良性的疾病。所以，延缓动脉粥样硬化的进展、稳定动脉粥样硬化易损斑块是冠心病防治的关键。细胞外基质金属蛋白酶诱导因子（Extracellular matrix metalloproteinase inducerEMMPRIN），首先发现于肿瘤细胞表面，能够增强MMPs的表达并促使肿瘤细胞迁移、浸润。属于免疫球蛋白超家族成员之一。30余年对EMMPRIN的研究发现这一蛋白不仅参与了视网膜、精子的形成以及免疫、神经生理反应，还参与肿瘤迁移、浸润以及亲环蛋白介导的炎症与氧化应激反应。现已经证实EMMPRIN在动脉粥样硬化相关细胞以及人类动脉粥样硬化斑块内高表达，2002年发现EMMPRIN在动脉粥样硬化斑块中表达并参与了动脉粥样硬化病变的发展，2005年有学者又用氧化型低密度脂蛋白诱导巨噬细胞向泡沫细胞分化,发现泡沫细胞中同样高表达EMMPRIN。越来越多的证据表明EMMPRIN参与了易损斑块破裂。EMMPRIN能够表达于多种细胞包括巨噬细胞、平滑肌细胞、血小板等血管活性细胞表面，作为细胞表面受体与亲环蛋白、单羧酸转运蛋白、整合素以及EMMPRIN本身结合，引起下游的包括诱导MMPs表达、氧化应激等多种信号途径。MMPs参与了动脉粥样硬化斑块的形成及失稳定性过程。虽然MMPs种类多，对MMPs的报道仍存在争议，但MMPs作为潜在的抗动脉粥样硬化因子一直广受关注。由于MMPs直接抑制剂效果不佳，所以对MMPs的上游的调节显得更为重要。EMMPRIN能够调节多种MMPs的从头合成，使EMMPRIN进入了动脉粥样硬化斑块的研究领域。从2002年Major等发现EMMPRIN表达于动脉粥样硬化斑块表面以后，研究已经发现EMMPRIN参与了泡沫细胞形成、血小板激活以及促炎症因子分泌信号途径。本课题组前期研究发现动脉粥样斑块内的主要效应细胞如平滑肌细胞、巨噬细胞均有不同程度的MMPs表达变化，并与EMMPRIN的下游促分裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号途径相关。进一步研究发现EMMPRIN可高表达于活化的巨噬细胞表面及APOE-/-小鼠动脉粥样斑块内，参与肾素-血管紧张素系统（RAS System）作用及MMP-9表达调控；并与动脉粥样硬化过程中重要的炎症信号因子（Nuclear factor-kappaB NF-κB）、环氧化酶2（Cyclooxygenase2COX-2）及前列腺素E2（prostaglandin E2PGE2）关系密切。以上研究高度提示MMPs共同的上游分子EMMPRIN可能通过某些途径影响动脉粥样斑块的稳定性。国内外已有研究者针对EMMPRIN的作用原理使用EMMPRIN单克隆抗体在动物模型有效预防和治疗风湿病和哮喘等疾病。据此我们推断EMMPRIN单克隆抗体也可能影响动脉粥样硬化斑块的进展及稳定性。本课题拟建立动脉粥样硬化小鼠模型，采用EMMPRIN单克隆抗体进行干预，研究其对动脉粥样硬化斑块的影响及内在机制。方法1.12只ApoE^-/-小鼠，8-10周龄，体重18-25g，购自北京大学动物中心。小鼠颗粒饲料购自第三军医大学实验动物中心，主要配方为常规饲料混合0.15%胆固醇和20%脂肪。分别喂养至12周，取血测定血脂变化情况、取主动脉油红O染色检测主动脉斑块负荷，鉴定动脉粥样硬化模型建立情况。Western blotting及组织免疫组化法检测EMMPRIN表达情况。2.建立EMMPRIN单克隆抗体干预高脂喂养的ApoE^-/-小鼠模型。40只ApoE^-/-小鼠，8-10周龄，体重18-25g，购自北京大学动物中心，共分为四组：正常饮食组（n=10），高脂喂养对照组（n=10），高脂喂养+EMMPRIN单克隆抗体干预组（n=10），高脂喂养+同型对照抗体干预组（n=10）。高脂饲料配方同前。在高脂喂养12周成功诱导出小鼠动脉粥样硬化后给予100ug EMMPRIN及同型对照单克隆抗体8次腹腔注射（4周，每周2次），正常饮食组及高脂喂养对照组给予等量生理盐水腹腔注射。共喂养16周后到达实验终点，处死小鼠，检测各项指标。3.检测各组小鼠的血脂、体重。行小鼠主动脉纵轴切面及无名动脉横切面的油红O染色。用HE染色检测无名动脉斑块形态，MASSON染色检测斑块内胶原沉积情况，利用MAC-3、SMC抗体分别标记巨噬细胞、平滑肌细胞行免疫组织化学检测斑块内组织成分，用抗EMMPRIN、亲环素A（Cyclophilin ACyPA）检测EMMPRIN、CyPA表达。4. ELISA的方法研究ApoE^-/-小鼠血清内TNF-α、IL-6、MCP-1变化情况。5.原位明胶酶谱法激光共聚焦检测小鼠无名动脉斑块内的明胶酶活性，明胶酶谱法检测小鼠主动脉蛋白匀浆内的mmp-2、9活性。6.Western Blotting法检测小鼠主动脉EMMPRIN、CyPA蛋白表达。7.二氢乙啶染色法（Dihydroethidium DHE）检测无名动脉斑块上的过氧化酶活性。8.细胞迁移试验检测EMMPRIN单克隆抗体对体外raw264.7巨噬细胞迁移的影响。9.统计学处理:计量资料以均值±标准差（mean±SD）表示。统计数据采用单因析比较（One-way ANOVA），以P<0.05为有显著性差异。统计学处理采用SPSS15.0软件。结果：1. APOE-/-小鼠动脉粥样硬化模型建立及EMMPRIN表达检测。①成功建立ApoE^-/-小鼠动脉粥样硬化模型。②检测EMMPRIN在ApoE^-/-小鼠各喂养时间段表达变化情况。Western blotting检测EMMPRIN在高脂喂养的ApoE^-/-小鼠4周、8周、12周表达较普通饮食喂养组明显升高，结果有显著性差异。免疫组化检测高脂喂养的4周、8周、12周ApoE^-/-小鼠主动脉EMMPRIN较普通喂养组明显升高。2. EMMPRIN单克隆抗体抑制ApoE^-/-小鼠动脉粥样硬化的进展。①结果示高脂喂养小组ApoE^-/-小鼠总胆固醇、甘油三酯、LDL较普通饮食喂养组明显升高，有统计学差异。EMMPRIN单克隆抗体处理对血脂未产生影响。EMMPRIN单克隆抗体对小鼠体重无影响。提示EMMPRIN单克隆抗体处理ApoE^-/-小鼠成功，EMMPRIN单克隆抗体未影响小鼠血脂变化，对小鼠无明显毒性作用。②EMMPRIN单克隆抗体减缓了小鼠动脉粥样硬化的形成。小鼠主动脉纵轴切面油红O染色结果显示：较普通饮食组，高脂组小鼠主动脉斑块负荷重；而EMMPRIN单克隆抗体干预组，损伤部位数量和面积均显著减少（P<0.05）。提示EMMPRIN单克隆抗体干预能够抑制粥样斑块形成。无名动脉横切面的油红O染色提示脂质沉积在EMMPRIN单克隆抗体组明显减少。本部分结果提示EMMPRIN单克隆抗体处理减缓了小鼠动脉粥样硬化斑块的形成。③EMMPRIN单克隆抗体改变了动脉粥样硬化斑块内的组织成分。较高脂喂养组，EMMPRIN单克隆抗体干预能够明显增加斑块内的胶原量；明显增加斑块内平滑肌细胞数目，减少巨噬细胞数量。本部分结果提示EMMPRIN单克隆抗体处理使小鼠动脉粥样硬化斑块趋于稳定。3. EMMPRIN单克隆抗体抑制ApoE^-/-小鼠动脉粥样硬化的进展的机制研究。①EMMPRIN单克隆抗体降低了ApoE^-/-小鼠动脉粥样硬化模型血清中IL-6、MCP-1含量。以ELISA的方法研究ApoE^-/-小鼠血清内TNF-α、IL-6、MCP-1变化情况，结果EMMPRIN单克隆抗体干预降低了血清中炎症因子IL-6、MCP-1的表达，结果有统计学差异，EMMPRIN单克隆抗体降低了炎症因子的表达，可能是减少动脉粥样硬化斑块形成的重要因素。②EMMPRIN单克隆抗体抑制了ApoE^-/-小鼠动脉粥样硬化模型的基质金属蛋白酶活性。斑块原位明胶酶谱法及主动脉蛋白明胶酶谱法检测小鼠无名动脉斑块内及主动脉蛋白匀浆内的明胶酶活性，结果均提示EMMPRIN单克隆抗体抑制了小鼠组织的基质金属蛋白酶活性。体外细胞实验示单克隆抗体处理后的raw264.7细胞迁移能力下降。EMMPRIN单克隆抗体降低了基质金属蛋白酶活性，减少了动脉粥样硬化斑块胶原降解，降低了巨噬细胞向动脉粥样硬化内膜迁移的能力。③EMMPRIN单克隆抗体通过CyPA减轻了ApoE^-/-小鼠动脉粥样硬化斑块的氧化应激反应。EMMPRIN单克隆抗体干预在没有减少主动脉CyPA的表达情况下，减低了CyPA在动脉斑块中与EMMPRIN的结合能力。无名动脉斑块上的过氧化酶DHE检测显示EMMPRIN单克隆抗体干预后，主动脉斑块的氧化应激明显减轻。EMMPRIN单克隆抗体阻断了CyPA与EMMPRIN的结合，从而减轻了氧化应激反应，可能是抑制动脉粥样硬化斑块形成、稳定斑块的重要因素。结论：1.成功建立ApoE^-/-小鼠动脉粥样硬化模型，发现EMMPRIN在动脉粥样硬化斑块中表达升高。2.成功建立EMMPRIN单克隆抗体干预ApoE^-/-小鼠动脉粥样硬化模型。EMMPRIN单克隆抗体处理减缓了小鼠动脉粥样硬化斑块的进展，使斑块趋于稳定。3.降低炎症因子的表达，抑制基质金属蛋白酶活性及巨噬细胞迁移，通过阻断CyPA与EMMPRIN的结合减轻氧化应激反应可能是EMMPRIN单克隆抗体延缓动脉粥样硬化斑块进展及稳定斑块的内在机制。