[研究背景]骨肉瘤是一个发生于儿童和青少年的常见的原发性骨肿瘤,易通过血行发生早期转移。用手术和辅助化疗联合治疗极大地提高了骨肉瘤病人的生存率。没有血行转移的病人5年生存率已经达到70%。然而,对化学疗法应答较弱的骨肉瘤病人,易发生局部复发和血行转移,尽管另外的药物的使用,该类骨肉瘤病人5年生存率也下降至仅仅约20%。药物耐药是预后不良的原因,减轻耐药性能使骨肉瘤病人得到更好地治疗。联合抗肿瘤药物和辅助药物的新的治疗方案能够促进抗肿瘤效果。在1966年,巨噬细胞移动抑制因子(macrophage migration inhibitory factor,MIF)作为一个能调节炎症的多功能蛋白质被发现。越来越多的证据表明,炎症与肿瘤的发生密切相关。MIF在炎症和肿瘤发生之间起到了一个桥梁的作用。MIF通过与它的膜受体结合激活MAPK和PI13K通路,导致细胞凋亡。最近一系列研究表明MIF参与细胞增殖、分化、血管形成和肿瘤的发生。一些证据显示MIF在各种肿瘤中高表达,与肿瘤的侵袭和转移显著相关。MIF已经被很好地证明参与恶性胶质瘤、乳腺癌、膀胱癌、直肠癌的表达,在骨肉瘤中也发现了MIF的高表达。有研究表明MIF基因的敲除能阻断骨肉瘤细胞的增殖和侵袭。然而,MIF在骨肉瘤的耐药中是否起作用还没有见报道。有研究揭示了在乳腺癌中MIF敲除通过诱导自噬促进了对化疗药物的敏感性。与之相反的是,有报道自噬能促进骨肉瘤对化疗药物的耐药。这些有争议的结果促使我们研究MIF在骨肉瘤自噬和耐药中的作用。在本文中,我们检测了一个被鉴定为3,4-二羟基-9,10-睾内酯-1,3,5,7-四烯-9,7-聚脂(3,4-dihydroxy-9,10-secoandrosta-1,3,5,7-tetraene-9,17-dione, DSTD)的新的雄烯二酮衍生物在骨肉瘤细胞自噬和药物耐药中的作用及机制。研究结果表明DSTD能抑制骨肉瘤细胞MG-63和U20S中MIF的表达。抗氧化剂NAC和自噬抑制剂3-MA均能减轻DSTD诱导的自噬却促进了细胞死亡,提示DSTD能诱导ROS介导的自噬来拯救细胞死亡。另外,DSTD抑制MIF通过下调骨肉瘤细胞HMGB1表达促进了对化疗的敏感性。我们的数据显示MIF抑制可以作为减轻骨肉瘤耐药性的一个治疗手段。第一部分DSTD对骨肉瘤细胞增殖、凋亡和MIF表达水平的影响[目的]探讨DSTD对骨肉瘤细胞MG-63和U20S增殖、凋亡的影响及MIF表达水平的影响。[方法]1.用含10%小牛血清(FBS)的DMEM培养基培养MG-63和U20S细胞,置于37℃、5%CO2培养箱内常规传代培养。取对数生长期的人骨肉瘤细胞用于后续的实验研究。2.用MTT实验和LDH释放实验检测不同浓度DSTD (0.1uM、10uM、 50uM、100uM)分别处理细胞24h后,统计DSTD对细胞增殖和凋亡的影响及浓度依赖性。3.100uM DSTD作用于MG-63和U20S细胞24h后,用实时定量逆转录聚合酶链反应(qRT-PCR)检测细胞内MIF mRNA的含量的变化,用Western Blot法检测细胞内MIF蛋白表达情况。4.统计学分析：应用SPSS21.0软件对数据进行统计分析。所有实验均重复3次,数据以均值士标准差(x士S)表示。两样本均数间比较采用t检验。以P<0.05判定为差异有统计学意义。[结果]1. DSTD能抑制MG-63和U20S细胞的生长,且呈一定浓度依赖性,但与对照组相比,差异无显著统计学意义。100uM DSTD作用于MG-63和U20S细胞24小时没有明显改变细胞的增殖活力和细胞的凋亡率。2. Real-time PCR结果100uM DSTD处理MG-63和U20S细胞24h后可显著降低MIF mRNA的转录水平。3. Western Blot结果：100μM DSTD处理MG-63和U20S细胞24h后,MIF蛋白表达水平明显降低。[结论]DSTD没有明显影响人骨肉瘤细胞MG-63和U20S的增殖活性和凋亡水平,但明显减少了人骨肉瘤细胞MG-63和U20S的MIF表达水平。第二部分DSTD通过抑制MIF的表达诱导骨肉瘤细胞ROS介导的自噬的研究[目的]通过研究DSTD作用于骨肉瘤细胞MG-63和U20S后检测MIF和自噬相关蛋白的表达,探讨DSTD诱导骨肉瘤自噬发生中的作用及分子机制。[方法]1.体外培养MG-63和U20S细胞株,取对数生长期的细胞进行实验研究。2. 100μM DSTD处理骨肉瘤细胞MG-63和U2OS 24h后和MIF ShRNA处理细胞48h后,分离细胞核和细胞质蛋白,用Western Blot检测MIF、Bcl-2、Bax、 pERK、Cyto HMGB1、Nucleic HMGB1蛋白的表达水平。3.100uM浓度的DSTD作用于MG-63细胞和U20S细胞不同时间(0h、4h、8h、12h、24h、48h)后用Westren Blot检测自噬相关基因LC3B-Ⅰ、LC3B-Ⅱ蛋白的表达水平。4.不同浓度DSTD(0uM,50uM、100uM)作用于骨肉瘤细胞U20S和MG-6324h后用Western Blot检测MIF、Bcl-2、Bax、pERK、HMGB1、LC3B-I和LC3B-Ⅱ蛋白的表达水平。5.用100uM DSTD与15mM NAC单独及联合作用于MG-63和U20S细胞不同时间后,分离细胞核和细胞质蛋白,用Western Blot检测MIF、Bcl-2、Bax、 pERK、PARP、c-PARP、LC3B-Ⅰ、LC3B-Ⅱ、Histone H3、Cyto HMGB1、Nucleic HMGB1蛋白的表达水平。用1mM 3-MA预处理MG-63和U20S细胞1小时后,用100uM DSTD作用24h,用Western Blot检测自噬相关蛋白LC3B-Ⅰ、LC3B-Ⅱ PARP、c-PARP的表达水平。6.MTT实验和LDH释放实验：用100uM DSTD与15mM NAC单独及联合作用于MG-63和U2OS细胞不同时间后,MTT法测定细胞增殖抑制率,LDH释放实验测定细胞毒性。用1mM 3-MA预处理MG-63和U20S细胞1小时后,用100uMDSTD作用24h, MTT法测定细胞增殖抑制率,LDH释放实验测定细胞毒性。7. Annexin V/PI (Annexin V-FITC)双染法流式细胞术测定细胞凋亡率：选用100uM DSTD或15mM NAC单独及联合作用于MG-63和U20S细胞不同时间后,用流式细胞仪(Beckman Coulter)进行检测分析凋亡。细胞用不含EDTA和酚红的胰蛋白酶进行消化后收集细胞,用PBS缓冲液冲洗3遍,细胞与5ul 20ug/ml的annexinV-FITC和5ul 20ug/ml的碘化丙啶在结合缓冲液中暗室中室温放置10min。随后标记的细胞用流式细胞仪进行检测,数据用流式分析软件WinMDI2.9进行分析处理。8. DCF-DA法测定活性氧自由基(Reactive oxygen species, ROS):选用100uM DSTD或15mM NAC单独及联合作用于MG-63和U20S细胞不同时间后,ROS的产生用氧化反应敏感的荧光试齐DCF-DA检测。收集不同条件作用后的细胞,用预冷处理的PBS冲洗细胞,随后加入DCF-DA使其终浓度为10uM/L,37℃培养30分钟。用PBS冲洗三遍后,用荧光显微镜检(LEICA DMIRE2)测荧光强度,以488nm激发波长和525nm发射波长设置参数。9.免疫荧光：选用100uM DSTD或15mM NAC单独及联合作用于MG-63和U20S细胞不同时间后,细胞用含4%多聚甲醛的PBS溶液固定30分钟,再用含0.2% Triton x-100的PBS渗透15分钟。随后细胞用10%的正常山羊血清封闭非特异性结合位点,室温放置1小时。用PBST漂洗三次后,加入MAP1-LC3E一抗4℃过夜,完毕后加入FITC结合的二抗孵育2小时。孵育完毕用PBST冲洗5次后,细胞用荧光显微镜观察(LEICA DMIRE2)。10.统计学分析：应用SPSS21.0统计软件对数据进行统计学分析。所有实验均重复3次,计量资料以x±s表示,两组间比较分别采用配对t检验。运用单因素方差分析比较多组之间数据是否有统计学差异。P<0.05认为差异有统计学意义。[结果]1.100uM DSTD和MIF shRNA均显著地抑制了MIF的表达,同时导致了Bcl-2的明显减少和Bax的明显增加(Bax/Bcl-2比值上调),抑制了ERK的磷酸化。胞核HMGB1的含量减少,而胞浆HMGB1含量增加。2.当用100μM DSTD作用于骨肉瘤细胞株24小时后,LC3B-Ⅰ明显地发生了向LC3B-Ⅱ的转化。LC3B-Ⅱ富集的量与DSTD作用时间呈正相关,这提示DSTD诱导的自噬呈现时间依赖性。3.分别用不同浓度DSTD处理U20S和MG-63细胞24h后,免疫蛋白印迹表明,随着DSTD浓度的增加,U20S和MG-63细胞中MIF、Bcl-2、pERK、HMGB1的表达逐渐降低,而Bax的表达逐渐增加。随着DSTD浓度的增加LC3B-Ⅱ富集量也逐渐增加。这提示DSTD诱导的自噬呈现浓度依赖性。4.我们检测了抗氧化剂NAC对DSTD诱导的信号传导的作用。Wetern blot结果显示,NAC共刺激逆转了DSTD诱导的信号传导途径,但DSTD诱导的PARP的富集PARP的剪切激活(c-PARP的形成)不能被NAC共刺激逆转。5.MTT结果显示抗氧化剂NAC共刺激后细胞增殖明显降低,LDH释放实验显示NAC共刺激后细胞毒性增加。6.流式细胞术结果显示,NAC共刺激促进了细胞凋亡。7.荧光素乙二脂染色法(DCF-DA)来追踪人骨肉瘤细胞株中ROS的产生。实验发现,ROS的产生量随着DSTD作用时间的增加而增高,但却能被NAC抑制。8.免疫荧光检测DSTD诱导的自噬,结果显示LC3的形成很明显,且呈时间依赖性。NAC共刺激减轻了DSTD诱导的自噬。9.3-MA能够减少DSTD诱导人骨肉瘤细胞U20S和MG-63产生的LC3B-Ⅱ表达水平。3-MA引起的自噬抑制作用也抑制了细胞增殖,并且促进了细胞凋亡,这提示我们DSTD诱导的自噬确实能延缓细胞死亡。[结论]DSTD可通过抑制MIF诱导U20S和MG-63细胞发生自噬,且呈现时间和剂量依赖性。DSTD诱导的自噬是ROS介导的,并且自噬延缓了细胞死亡。第三部分DSTD对骨肉瘤细胞耐药性的影响及机制[目的]探讨DSTD在骨肉瘤细胞化疗药物耐药中的作用及其分子机制。[方法]1.体外培养MG-63和U20S细胞株,取对数生长期的细胞进行实验研究。2.用0.5uM的阿霉素或50uM的顺铂在100uM的DSTD存在或不存在的情况下处理24h后在显微镜下观察人骨肉瘤细胞U20S和MG-63形态的改变。3.MTT实验检测不同浓度化疗药物阿霉素或顺铂单独及联合DSTD对人骨肉瘤细胞增殖活性的影响。4.细胞用0.5uM的Dox或50uM的Cis在100uM的DSTD存在或不存在的情况下共刺激MG-63和U20S细胞24h。用Western blot检测MIF. HMGB1和ERK的表达水平。用Real-time PCR检钡HMGB1的mRNA表达水平。5.MG-63和U20S细胞转染GV230-HMGB1质粒DNA 72h后,Western Blot检测HMGB1过表达对HMGB1、pERK、LC3和PARP蛋白表达的影响,LDH释放实验检测]HMGB1过表达对细胞凋亡的影响。6.统计学方法：应用SPSS21.0统计软件对数据进行统计学分析。所有实验均重复3次,计量资料以x±s表示,两组间比较分别采用配对t检验。运用单因素方差分析比较多组之间数据是否有统计学差异。P<0.05认为差异有统计学意义。[结果]1.与对照组比较,DSTD导致细胞轻微的皱缩,而阿霉素和顺铂部分导致细胞皱缩。在DSTD和化疗药物阿霉素或顺铂一起联合作用于人骨肉瘤细胞的时候,引起了大批的细胞死亡。2.化疗药物阿霉素和顺铂以剂量依赖的方式减少了细胞增殖。DSTD与化疗药物阿霉素或顺铂联合使用比化疗药物单独使用导致细胞增殖减少更为明显,DSTD-同作用提高了骨肉瘤细胞对阿霉素和顺铂的敏感性。3. Western blot结果显示100uM的DSTD逆转了Dox和Cis诱导的HMGB1蛋白表达水平升高。Real-time PCR结果显示100uM的DSTD也减少了Dox和Cis诱导的HMGB1 mRNA转录水平升高。4. Western Blot检测结果提示：在化疗时,HMGB1的过表达阻断了DSTD诱导的信号转导。5.LDH释放实验结果显示：在化疗时,HMGB1的过表达阻断了DSTD诱导的细胞死亡。[结论]HMGB1过表达诱导的自噬拯救了细胞死亡,而DSTD抑制MIF通过下调HMGB1的表达促进了细胞死亡,减轻了人骨肉瘤细胞对化疗药物的耐药性。