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背景和目的胃癌（Gastric cancer,GC）是全球癌症相关死亡的第四大原因。尽管手术和辅助治疗方法有所改进,但胃癌患者仍表现出“三高三低”的特征,即转移率、发病率、死亡率高,根治性切除率、早期诊断率、5年生存率低。有限的治疗策略及术后高复发率、高转移率使开发新的化学预防药物具有重要意义。药物再利用是指利用现有已被食品药品监督管理局（Food and Drug Administration,FDA）批准的药物用于治疗新的疾病,与开发一种新药相比可以节省大量时间和金钱,并且其安全性,稳定性得到保障。目前,一些临床用药如阿司匹林,二甲双胍,布洛芬和他汀类药物在胃癌的化学预防中已得到广泛研究。因此,从已有的临床用药中筛选具有治疗或预防GC的药物是一种有效的策略。酪氨酸蛋白激酶2（Tyrosine-protein kinase 2,JAK2）和原癌基因酪氨酸蛋白激酶（Proto-oncogene tyrosine-protein kinase,SRC）在多种癌症中高表达。JAK2作为信号传导中枢,将白介素受体和致癌激酶受体介导的胞外信号整合到信号转导和转录激活因子3（Signal transducers and activators of transcription,STAT3）上。当酪氨酸被磷酸化,STAT3蛋白就会形成异源或同源二聚体进入胞核并与相应的DNA序列结合并促进下游基因的转录。SRC激酶调节多种信号通路,包括Ras/Raf/ERK1/2、PI3K/Akt和STAT3,从而促进细胞增殖、分化、存活、迁移、侵袭和血管生成。因此,以JAK2和SRC激酶为治疗靶点对胃癌的化学预防具有重要意义。沃替西汀氢溴酸盐在临床上靶向5羟色胺受体治疗抑郁症和广泛焦虑症。而本研究发现沃替西汀氢溴酸盐是JAK2和SRC激酶的双靶点抑制剂,通过JAK2/SRC-STAT3信号通路在体内外抑制胃癌细胞的生长,为沃替西汀氢溴酸盐作为胃癌化学预防药物奠定了实验基础和理论依据。方法1.评价沃替西汀氢溴酸盐在体外对胃癌细胞增殖的抑制作用。通过细胞毒性实验检测沃替西汀氢溴酸盐对胃癌细胞系的毒性作用;通过细胞生长实验,非锚定依赖性生长实验和锚定依赖性生长实验检测沃替西汀氢溴酸盐对胃癌细胞系增殖和克隆形成的抑制作用。2.探索沃替西汀氢溴酸盐抑制胃癌细胞生长的作用靶点。运用计算机分子对接模型预测沃替西汀氢溴酸盐与胃癌细胞作用的潜在结合位点;通过蛋白下拉实验,细胞热位移测定法进一步来验证沃替西汀氢溴酸盐与JAK2和SRC激酶的结合。3.探究沃替西汀氢溴酸盐抑制胃癌细胞生长的作用机制。通过体外激酶实验评价沃替西汀氢溴酸盐对JAK2和SRC激酶活性的影响;通过细胞免疫荧光实验检测沃替西汀氢溴酸盐对p-STAT3的影响;通过非变性凝胶实验,核浆分离实验进一步验证STAT3二聚化,核移位的变化,以及通过Western blotting检测STAT3下游基因c-Myc,抗凋亡蛋白（Induced myeloid leukemia cell differentiation protein Mcl-1）和B细胞淋巴瘤2（Bcl-2）蛋白表达水平的变化。4.研究JAK2激酶对胃癌细胞增殖的影响。使用CRISPR/Cas9系统,转染含有sg JAK2的慢病毒质粒,构建JAK2敲除的胃癌细胞系HGC27和AGS,进而验证敲除JAK2对胃癌细胞生长和克隆形成能力的影响以及沃替西汀氢溴酸盐对JAK2敲除细胞敏感性的改变。5.研究SRC激酶对胃癌细胞增殖的影响。使用CRISPR/Cas9系统,将含sg SRC的慢病毒质粒感染胃癌细胞构建SRC敲除细胞,进而验证敲除SRC对胃癌细胞增殖和克隆形成能力的影响以及沃替西汀氢溴酸盐对SRC敲除细胞敏感性的改变。6.评价沃替西汀氢溴酸盐在体内对胃癌患者源性的异种移植模型（PDX模型）的抑制作用。通过构建PDX模型,观察沃替西汀氢溴酸盐在体内抑制胃癌肿瘤生长的效果;通过免疫组织化学染色检测沃替西汀氢溴酸盐处理后,胃癌肿瘤组织中Ki-67及p-STAT3 Y705蛋白表达水平的变化;通过Western blotting进一步检测肿瘤组织中STAT3,c-Myc,Mcl-1,Bcl-2蛋白表达水平的变化。结果1.沃替西汀氢溴酸盐在体外抑制胃癌细胞的生长。沃替西汀氢溴酸盐以时间和浓度依赖性抑制胃癌细胞的增殖;沃替西汀氢溴酸盐抑制胃癌细胞非锚定依赖性生长和锚定依赖性生长的能力。2.沃替西汀氢溴酸盐直接与JAK2和SRC激酶结合。计算机分子对接模型实验预测JAK2和SRC激酶可能为沃替西汀氢溴酸盐作用胃癌细胞的潜在靶点;进而通过蛋白下拉实验证明沃替西汀氢溴酸盐分别与JAK2和SRC重组蛋白,HGC27,AGS细胞裂解液JAK2和SRC蛋白结合;通过细胞热位移测定法进一步证实沃替西汀氢溴酸盐在完整细胞内与JAK2和SRC结合。3.沃替西汀氢溴酸盐通过JAK2/SRC-STAT3信号通路抑制胃癌细胞的生长。体外激酶实验表明沃替西汀氢溴酸盐显著抑制JAK2和SRC的激酶活性,p-STAT3 Y705明显减弱;细胞免疫荧光实验证实沃替西汀氢溴酸盐抑制STAT3Y705的磷酸化;非变性凝胶实验和核浆分离实验分别证明沃替西汀氢溴酸盐抑制STAT3二聚化的形成及核移位;通过Western blotting验证了沃替西汀氢溴酸盐抑制STAT3的转录活性,其下游因子c-Myc,Mcl-1和Bcl-2的蛋白表达水平明显降低。4.敲除JAK2降低胃癌细胞对沃替西汀氢溴酸盐的敏感性。在胃癌细胞中敲除JAK2,通过细胞增殖和平板克隆实验证实细胞的增殖和克隆形成能力受到抑制;对敲除JAK2细胞进行加药处理,结果表明JAK2敲除细胞对沃替西汀氢溴酸盐的敏感性降低。5.敲除SRC降低胃癌细胞对沃替西汀氢溴酸盐的敏感性。在胃癌细胞中敲除SRC,细胞增殖和平板克隆实验表明细胞的生长和克隆形成能力受到抑制;对敲除SRC细胞进行加药处理,结果表明敲除细胞对沃替西汀氢溴酸盐的敏感性降低。6.沃替西汀氢溴酸盐在体内抑制胃癌人源肿瘤异种移植瘤（patient-derived xenograft,PDX）的生长。动物实验表明沃替西汀氢溴酸盐在体内对显著抑制胃癌肿瘤的生长;免疫组织化学染色结果表明经沃替西汀氢溴酸盐处理后,胃癌肿瘤组织中Ki-67和pSTAT3 Y705的蛋白水平明显下降;Western blotting实验结果表明,胃癌肿瘤组织中STAT3,c-Myc,Mcl-1和Bcl-2的蛋白表达水平明显降低。结论1.沃替西汀氢溴酸盐在体外抑制胃癌细胞的增殖和克隆形成,在体内抑制胃癌人源肿瘤异种移植瘤的生长;2.沃替西汀氢溴酸盐与JAK2和SRC激酶结合,并抑制其激酶活性,是JAK2/SRC激酶抑制剂;3.沃替西汀氢溴酸盐通过抑制JAK2和SRC激酶活性,抑制STAT3二聚化的形成、核移位及转录活性,在体内外抑制胃癌的生长。