研究背景阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease, AD)是一种起病隐袭的中枢神经系统退行性疾病,以记忆力进行性减退、认知功能障碍、行为活动异常为主要临床特征。其患病率约占老年痴呆病例的一半以上,随着人口老龄化的加重,阿尔茨海默病的发病率逐年增高。AD严重影响患者的工作能力和生活质量,也为家庭和社会带来沉重的负担。鉴于AD的发病机制尚未阐明,目前尚无理想的预防和治疗方法。AD的主要病理特征是在患者大脑皮质、海马、某些皮质下神经核出现老年斑(senile plaque, SP)和神经原纤维缠结(neurofibrillary tangle, NFT),此外还有神经元缺失、星形细胞增生样反应、神经元突触异常等病理改变。AD的核心症状是认知功能进行性下降,谷氨酸能及胆碱能神经元丢失程度与患者智能衰退关系密切。因此,减少神经元丢失或增加神经再生是AD治疗的重要方向。粒细胞集落刺激因子(granulocyte colony-stimulating factor, G-CSF)是由单核细胞、成纤维细胞和内皮细胞产生的一种造血生长因子,能与细胞表面的特定受体结合,促使中性粒细胞系造血祖细胞生长和分化,保护中性粒细胞避免凋亡并加强它们的功能,G-CSF被广泛地应用于治疗由各种原因引起的粒细胞减少症。最近多项研究显示其对中枢神经系统也有多重效应,可促进骨髓源性干细胞向受损脑区迁移,抗细胞凋亡,促进神经细胞再生。神经干细胞存在大脑特定区域,特别是脑室下区(管膜)、嗅球和海马,这些区域均可表达G-CSF及G-CSFR。G-CSF具有神经保护作用,能促进组织形态修复和神经功能康复。近年来,对成年动物脑缺血模型的研究表明,应用G-CSF是一种有效治疗方法,Kawada等研究发现,缺血性脑卒中动物模型经G-CSF治疗,能通过动员骨髓干细胞而改善卒中后脑功能受损症状。国外应用G-CSF治疗成人缺血性脑卒中已进入Ⅰ、Ⅱ期临床观察阶段。根据以往研究推测,G-CSF可能通过促进神经再生治疗AD,改善AD患者的认知功能。本研究将G-CSF应用于APPV717I转基因AD模型小鼠,以探讨G-CSF能否促进神经再生和改善转基因小鼠认知能力。本研究共分三部分,如下：第一部分G-CSF对阿尔茨海默病小鼠认知功能的影响目的对G-CSF治疗前后AD模型小鼠、对照组和野生小鼠进行生物行为学研究,利用水迷宫模型来测试各组小鼠学习记忆能力,探讨G-CSF能否改善AD小鼠模型的认知能力。方法1.将10月龄APPV717I转基因AD模型小鼠和野生小鼠分为对照组、G-CSF治疗组和野生组。G-CSF治疗组：连续7d皮下注射G-CSF(50μg/kg·d)。对照组、野生组,连续7d皮下注射PBS。按照G-CSF治疗完成后的天数,各组小鼠又分为三个亚组：7d组,14d组,28d组。2.各组小鼠于注射前后分别进行水迷宫定位航行试验。3.利用统计软件对G-CSF治疗前后的AD模型小鼠及野生小鼠的水迷宫实验数据进行统计分析。观察G-CSF对AD模型小鼠认知功能的影响。结果各组小鼠Morris水迷宫测试结果：AD模型组逃避潜伏期和游泳距离较野生组明显延长(P<0.01),G-CSF治疗组显著缩短潜伏期和游泳距离,和野生组水平相当。同组大鼠,随着训练时段的增加,G-CSF治疗组的潜伏期和游泳距离越来越短(P<0.01)。各组小鼠游泳速度没有明显差异。可以排除因个体差异引起的不同。结论G-CSF治疗后阿尔茨海默病小鼠认知功能改善。第二部分G-CSF对阿尔兹海默病小鼠CD 34+/ CD 45+细胞比例的影响目的应用流式细胞学的方法观测G-CSF治疗前后APP转基因模型小鼠外周血中CD 34+/CD 45+细胞比例,探讨G-CSF对阿尔茨海默病模型小鼠骨髓造血干细胞的影响。方法1.将10月龄APPV7171转基因AD模型小鼠分为对照组,G-CSF治疗组。G-CSF治疗组：连续7d皮下注射G-CSF(50μg/kg·d)。对照组：连续7d皮下注射PBS。2.给药第14 d Morris水迷宫测试后从小鼠眶后静脉丛取外周血0.5 ml,进行流式细胞学测试,观察2组小鼠外周血中CD 34+/CD 45+细胞比例。结果治疗组小鼠外周血CD 34+/CD45+细胞数较对照组明显增加(P<0.01),约为对照组3倍。结论1.G-CSF能提高AD模型小鼠外周血中CD 34+/CD 45+细胞的比例。2.G-CSF能够动员AD模型小鼠CD34+的骨髓造血干细胞(hematopoietic stem cells,HSC)增殖并进入外周血。第三部分G-CSF对阿尔兹海默病小鼠脑内神经元再生的影响目的对G-CSF治疗前后AD模型小鼠脑组织切片进行免疫组化及免疫荧光双标检测,通过CD 34+免疫荧光染色、Nestin+/BrdU+、MAP-2+/BrdU+免疫荧光双重标记,观察G-CSF能否影响AD小鼠模型脑内的神经再生方法1G-CSF治疗组：连续7d皮下注射G-CSF(50μg/kg·d)。对照组：连续7d皮下注射PBS。给药同时,两组动物给予BrdU(50 mg/kg·d)腹腔注射,连续10d。2.在给药后14d将两组小鼠多聚甲醛灌注取脑,冰冻切片,CD 34+免疫荧光染色、Nestin+/BrdU+、MAP-2+/BrdU+免疫荧光双重标记。结果1.治疗组在给药后第14d时脑内的皮质、嗅球及海马区可检测到红色的CD 34+细胞。2.在两组小鼠脑内的皮质、嗅球及海马区均检测到BrdU+细胞,治疗组较对照组显著增加(p<0.05)。3.应用免疫荧光双标染色,在皮质、嗅球及海马区均可见Nestin+/BrdU+、MAP-2+/BrdU+双阳性细胞,较对照组明显增加(p<0.05)。结论1.G-CSF可诱导AD模型小鼠骨髓造血干细胞向脑内迁移。2.G-CSF能明显促进AD模型小鼠脑内细胞增殖。3.G-CSF可诱导AD模型小鼠脑中神经干细胞增殖并向神经元方向分化。研究意义本研究结果表明G-CSF皮下注射可明显改善APP转基因小鼠的认知功能,其作用机制为动员外周骨髓造血干细胞增殖、分化,并向脑内定向迁移；同时诱导脑内神经干细胞增殖、向神经元分化,从而替代丢失的神经元,修复病灶,为G-CSF治疗阿尔茨海默病提供了新的实验依据。