【摘 要】
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目的:胶质母细胞瘤是颅内恶性程度最高、侵袭性最强的肿瘤。虽然目前采取手术联合放化疗能延长患者的生存时间,但5年生存率也仅达到9.8%,其中最重要的原因是血脑屏障与血瘤屏障限制了杀伤作用较好的化疗药进入颅内。所以解决血脑屏障的限制作用是治疗恶性脑胶质瘤的重要问题。基于嵌合抗原受体T细胞（CAR-T）的免疫疗法是一项新兴的抗肿瘤治疗手段,CAR-T细胞靶向性强、能透过血脑屏障,但受制于肿瘤的异质性和免
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目的:胶质母细胞瘤是颅内恶性程度最高、侵袭性最强的肿瘤。虽然目前采取手术联合放化疗能延长患者的生存时间,但5年生存率也仅达到9.8%,其中最重要的原因是血脑屏障与血瘤屏障限制了杀伤作用较好的化疗药进入颅内。所以解决血脑屏障的限制作用是治疗恶性脑胶质瘤的重要问题。基于嵌合抗原受体T细胞（CAR-T）的免疫疗法是一项新兴的抗肿瘤治疗手段,CAR-T细胞靶向性强、能透过血脑屏障,但受制于肿瘤的异质性和免疫抑制微环境,其在胶质瘤的治疗中效果欠佳;而SN-38化疗药物则可以通过血管渗漏作用进入肿瘤内部,能克服肿瘤的异质性与免疫抑制微环境,但因颅内血脑屏障和血瘤屏障存在,其缺乏有效的抗肿瘤效果。那么能否将二者优点结合起来,利用新的抗肿瘤策略,将CAR-T细胞作为药物载体治疗恶性胶质瘤呢?方法:从薄膜-探超法、乙醇注入法等中选择薄膜-探超的方法来制备SN-38脂质体。通过51Cr同位素释放法实验比较SN-38-L、EGFRvⅢ-CAR-T及SN-38-L-EGFRvⅢ-CAR-T杀伤肿瘤细胞的能力。通过磁珠分选方法提取外周T细胞,并通过基因改造工程技术,构建EGFRvⅢ-CAR-T细胞,从免疫荧光、WB/PCR、细胞毒性实验等体内外实验评价SN-38-EGFRvⅢ-CAR-T细胞载体系统构建效果及杀伤肿瘤细胞的作用。结果:通过建立化疗药物SN-38的分析条件,确定了SN-38-L脂质体的最佳合成条件,即成膜温度45度,水合温度45度,水合时间45分钟,磷脂浓度为20mg/ml,磷脂胆固醇比为4:1,其中MAL-PEG浓度为1mg/ml。按照最优化条件合成脂质体后,测得SN-38脂质体的包封率和载药量,分别为89%,3.27ug。通过CCK8实验,我们发现在相同浓度下,SN-38对胶质瘤细胞系u87和U251的杀伤作用比替莫唑胺的杀伤作用高出10倍以上,且SN-38在低浓度（<2ug/ml）的范围内对胶质瘤细胞系和T细胞产生差异性的杀伤效果。通过基因工程技术改造T细胞,分析发现表达CAR蛋白的T细胞约占11.21%-22.71%%。其中连接SN-38-L脂质体的T细胞约占30.27-42.35%。正常未激活的T细胞、EGFRvⅢ-CAR T、SN-38-L-EGFRvⅢ-CAR T分别与肿瘤细胞按照不同的比例进行共培养,发现SN-38-L-EGFRvⅢ-CAR T的杀伤肿瘤效果较其他组明显且从体内实验中,SN-38-L-EGFRvⅢ-CAR T具有更强的抑制肿瘤生长的能力。结论:SN-38-L-EGFRvⅢ-CAR-T相较于单独的CAR-T细胞治疗,不仅能发挥其自身的免疫杀伤效果,而且能作为药物载药实现化疗药物的靶向运输,实现免疫治疗与药物治疗的联合抗肿瘤效应,具有较好的临床应用前景。
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