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目的:构建特异性强,转染率高,携带针对人Survivin的shRNA的肿瘤增殖型腺病毒载体,研究其介导的以人Survivin为靶标的RNA干扰对结肠癌细胞株HT-29中Survivin mRNA和蛋白的表达、对结肠癌细胞HT-29增殖和凋亡的影响、时效性及其意义,探讨肿瘤增殖型腺病毒介导RNA干扰对结肠癌的治疗作用。方法:将针对人Survivin的shRNA的基因序列及EGFP基因序列克隆至肿瘤增殖型腺病毒穿梭质粒pAd-delE1b55KD;在HEK-293细胞中包装出毒得到重组腺病毒Ad-delE1b55KD-shRNA/Survivin-EGFP并测序鉴定。用Ad-delE1b55KD-shRNA/Survivin-EGFP转染结肠癌细胞株HT-29(以携带相同shRNA的增殖缺陷型腺病毒和脂质体载体以及携带阴性对照shRNA的肿瘤增殖型腺病毒为对照),用RT-PCR和Western-blot分别检测转染后的HT-29细胞中Survivin mRNA和蛋白表达量的变化,用MTT法、吖啶橙/溴乙锭荧光染色法、Annexin V-PE/7-AAD联合染色法检测细胞死亡率及凋亡率。同样方法转染HT-29细胞株,于转染后1天、7天、14天、28天分别检测其携带的外源性EGFP基因的表达及被转染HT-29细胞中Survivin mRNA和Survivin蛋白的表达情况。结果:序列测定证明针对人Survivin的shRNA序列及EGFP序列被成功构建到肿瘤增殖型腺病毒载体中;该腺病毒对结肠癌细胞HT-29的转染效率显著高于增殖缺陷型腺病毒载体和脂质体载体(P<0.01);而对肝细胞的转染率则显著低于对结肠癌细胞株HT-29的转染(P<0.01)。与复制缺陷型腺病毒载体和脂质体载体以及携带阴性对照shRNA的肿瘤增殖型腺病毒比较,转染Ad-delE1b55KD- shRNA/Survivin-EGFP后,HT-29细胞中Survivin mRNA拷贝数及蛋白表达显著降低(P<0.01),且结肠癌细胞HT-29的细胞死亡率和凋亡率明显提高(P<0.01)。在转染后第7天,实验各组的外源性EGFP基因均有较高表达, Survivin mRNA及蛋白的表达被抑制,Ad-delE1b55KD-shRNA/Survivin-EGFP组的EGFP表达明显高于复制缺陷型腺病毒载体和脂质体载体载体;在转染后第14天,后二者携带的外源性EGFP基因表达、Survivin mRNA及Survivin蛋白表达的抑制作用显著下降,而上述作用及表达在Ad-delE1b55KD- shRNA/Survivin-EGFP组仍然很强;转染后28天,后二者携带的外源性基因表达、Survivin mRNA及Survivin蛋白表达的抑制作用基本消失,而Ad-delE1b55KD-shRNA/Survivin-EGFP组仍然保持很高的EGFP表达率和RNA干扰效率。(P<0.01)。结论:本研究结果提示构建成功携带针对人Survivin的shRNA的肿瘤增殖型腺病毒载体Ad-delE1b55KD-shRNA/Survivin-EGFP,其能选择性地高效转染结肠癌细胞株HT-29并有效干扰Survivin,且较之增殖缺陷型腺病毒载体和脂质体载体以及携带阴性对照shRNA的肿瘤增殖型腺病毒具有更高的干扰效率,能高效地诱导结肠癌细胞凋亡并抑制其增殖。其介导RNA干扰能长时间高效率地沉默结肠癌细胞HT-29中的Survivin基因表达。